Как получить выписку из приказа

Просто так выписку, конечно, никто никому не даст. Прежде чем ее получить, требуется составить письменное заявление, в котором необходимо указать, из какого именно приказа нужна выписка и для каких целей. Затем заявление желательно завизировать у секретаря организации (на тот случай, если возникнут какие-либо разногласия по части выдачи документа).

Следует отметить, что выписки могут запрашиваться как из действующих приказов, так и из тех, которые уже ушли в архив компании.

Правила составления выписки из приказа

Выписка из приказа, ровно как и сам приказ не имеет стандартного унифицированного образца, обязательного к применению, поэтому оформлять его можно в свободном виде. Довольно часто предприятия используют специальные шаблоны, разработанные внутри компании (они обязательно должны быть учтены в учетной политике организации). Но, вне зависимости от того, какой вариант будет выбран, важное условие: в документе всегда должно быть указано

• название фирмы,
• дата и место составления выписки,
• подпись ответственных сотрудников, которые таким образом заверяют то, что сведения, внесенные в выписку верны.

Удостоверять документ печатью необязательно, поскольку, с 2016 года юридические лица могут не использовать в своей работе печати и штампы (единственный нюанс — государственные и банковские организации довольно часто по инерции продолжают требовать наличие оттиска на документе, поэтому если печать есть, воспользоваться ею лишним не будет).

Сам текст выписки должен в точности копировать содержание приказа, никакие изменения и корректировки в нем совершенно недопустимы.

Выписка может быть оформлена как от руки, так и напечатана на компьютере, ее можно также отсканировать и распечатать или отксерокопировать, главное – наличие «живого» автографа. В качестве формы может быть использован фирменный бланк компании или же простой лист А4 формата – это значения не имеет, однако первый вариант удобнее, поскольку он изначально содержит в себе все необходимые реквизиты.

Фиксировать факт выдачи выписки во внутреннем журнале учета документов не обязательно, но желательно.

Пример составления выписки

1. Вверху документа пишется полное наименование компании, выпустившей приказ, из которого делается выписка.
2. Затем посередине строки указывается название документа и номер по внутреннему документообороту предприятия.
3. После этого нужно указать населенный пункт, в котором работает организация и дату составления документа.
4. Далее идет собственно сам текст, который должен в точности цитировать ту часть приказа, которой касается выписка.
5. В завершение документ необходимо подписать у директора, а также заверить автографом ответственного лица.

Выписка из приказа – образец оформления

В практической деятельности выписка из приказа (как и из любого документа) готовится, если документ имеет большой объем, а требуемая информация занимает только небольшую его часть, либо из соображений конфиденциальности. Во всех других случаях проще просто сделать копию необходимого документа.

Выписку из приказа по основной деятельности обычно оформляют по следующему образцу:

• полностью воспроизводят реквизиты бланка приказа, при этом вид документа «ПРИКАЗ» заменяют на «ВЫПИСКА ИЗ ПРИКАЗА», регистрационный номер и дату приказа не изменяют в выписке,
• начальную часть (преамбулу) приказа повторяют полностью, если она отсутствует, то ограничиваются словом «приказываю:»,
• в выписку из распорядительной части переносят только необходимый пункт (ы) приказа,
• указывают наименование должности подписавшего приказ, инициалы, фамилию, сама личная подпись отсутствует в выписке из приказа,
• необходимо заверить выписку из документа (надпись «Верно», оформление должности, подписи заверяющего с расшифровкой, поставить дату, для сторонней организации нужна печать) – аналогично заверению копии документов, подробнее на эту тему в отдельной статье.

Оформление выписки из приказа по личному составу проводится по похожему образцу. Отличие заключается в отсутствии преамбулы, части текста объясняющей причины издания приказа. Поэтому из распорядительной части воспроизводится интересующий пункт («Принять…», «Перевести…» и т.д.), остальное совпадает с оформлением выписки из приказа по основной деятельности.

Все вышеперечисленное будет лучше посмотреть на конкретном примере оформления.

Образец выписки из приказа

ОТКРЫТОЕ АКЦИОНЕРНОЕ ОБЩЕСТВО «ДАЛЕКО»
(ОАО «Далеко»)

ВЫПИСКА ИЗ ПРИКАЗА

« 19 » марта 2014 г.                                                                                           № 138
г. Владимир

О создании экспертной комиссии

В целях организации работы по проведению экспертизы ценности документов п р и к а з ы в а ю:

2. Начальнику канцелярии Кузовкиной О.Л. разработать положение об экспертной комиссии до 22.04.2014.

Директор                                                                                                         Д. А. Молочкова

Верно
Секретарь      Подпись         О.Е. Шкваркина
20.03.2014

Я думаю, теперь оформление выписки из приказа не вызовет у вас абсолютно никаких затруднений.

Евгения Полоса

Спасибо Вам за добавление этой статьи в:

Еще интересное по теме:

К записи 38 комментариев

Выписка из приказа: образец

Для предоставления данных о сотруднике в стороннюю организацию или другой отдел по запросу готовят выписку из приказа. Иногда делается просто копия основного документа. Однако ввиду большого объема распоряжений и из соображений конфиденциальности предпочтительно сделать выписку из приказа. Она содержит в себе все реквизиты организации и требуемую информацию о работнике. Как правило, бланк запрашивается в Пенсионный фонд и другие инстанции. В конце статьи по ссылке можно скачать выписку из приказа образец.

Виды выписок и их предназначение

Все основные назначения на предприятии фиксируются приказами. Некоторые из них по объему могут достигать нескольких страниц. Выписка представляет собой краткую выдержку из документа, которая отвечает теме запроса. Потребоваться она может Пенсионному фонду и прочим органам.

Вторая причина, по которой целесообразно написать такую выдержку, а не делать копию всего текста – сохранение конфиденциальности данных. Некоторые распоряжения относятся сразу к нескольким работникам. Поэтому если нужно предоставить данные только по одному человеку, целесообразно подготовить краткую цитату.

На практике оформляется два вида выписок:

• по личному составу, в таком бланке отражается вся распорядительная часть;
• по основной деятельности, где прописывается только констатирующая часть распоряжения.

В большинстве случаев такой бланк включает только один пункт. Например, в оформленном документе может подтверждаться информация о принятии лица на определенную должность, о его переводе или увольнении. Грамотно подготовленные выписки из приказа имеют такую же юридическую силу, как и сами распоряжения.

Как правильно оформить документ

Выписки из приказа оформляются по тому же принципу, что и сами распоряжения. В них содержатся реквизиты предприятия: наименование, ИНН, адрес местонахождения, телефон.

Далее представлен план, поясняющий, как оформить выписку.

1. Наименование предприятия, совпадающее с указанным в Уставе. Если имеется вышестоящая организация, вначале вносят ее название, а затем – название филиала.
2. Регистрационный номер. Совпадает с прописанным в распоряжении.
3. Дата – так же, как и в приказе.
4. Вид документа – «Выписка из приказа». Название пишется по центру, без точки в конце.
5. Констатирующая часть (когда готовятся выписки из приказа по основной деятельности). Если речь идет о распоряжении по личному составу, по тексту оформляемого документа далее пишется слово «Приказываю».
6. Распорядительная часть (только по тому работнику, на которого готовится бланк).
7. Фамилия и инициалы, должность подписавшего приказ.

Выписка из приказа о приеме на работу требует заверения. После текста ставится пометка «Верно», затем следует подпись оформившего ее начальника кадрового отдела или другого уполномоченного сотрудника. Стоит заметить, что руководитель этот документ не подписывает.

Важно! Чтобы оформить выписку из приказа, нужно взять фирменный бланк организации.

Нужна ли печать? Если выдержки оформляются для сторонней организации, то да. Оттиск должен покрывать ФИО и подпись уполномоченного сотрудника, заверявшего документ. Однако если бланк находится в рамках внутреннего документооборота, ставить печать не нужно.

Какие сроки установлены в отношении выписок

Стоит отметить, что не существует нормативного акта, ограничивающего срок действия выписки. Значит, документ считается бессрочным.

Готовая выдержка из приказа хранится в личном деле. Поэтому ее срок хранения на предприятии напрямую зависит от того, как долго будет оставаться в кадровом отделе личное дело.

Что можно сказать о сроке предоставления бланка по запросу? Он составляет три дня. Чаще всего такие запросы направляют контролирующие организации либо вышестоящие отделения.

Разновидности выписок из приказов

Хотя сделана выдержка на базе основного приказа, она считается отдельным документом. Чтобы найти само распоряжение, стоит воспользоваться журналом регистрации приказов. В зависимости от содержания, бланки будут иметь некоторые отличия.

Выдержки могут потребоваться из следующих распоряжений:

1. О приеме на работу. Составляется по описанному выше плану. Может потребоваться для подтверждения трудоустройства и начисления пенсии.
2. Об увольнении. Такие выписки требуются при оформлении на следующее рабочее место, при утере трудовой книжки или для государственных органов.
3. О назначении на должность. Для бланка актуальны общие правила. В документ переносится пункт, где говорится непосредственно о назначении на должность.
4. О премировании. Такой приказ оформляется сразу на нескольких работников, поэтому из него можно получить только выписку. Копии документа не предоставляют с целью сохранения конфиденциальных данных.
5. Об учетной политике. Эти выдержки требуются для налогового либо бухгалтерского учета.
6. О командировке. Указывается констатирующая часть, начинается со слова «Приказываю».
7. Об отпуске. Помимо распоряжения руководства, в текст следует включить основания для предоставления отдыха. Потребуется включить перечень подтверждающих это документов, где написано, по какой причине работник уходит в отпуск.
8. По основной деятельности. Предназначение такого распоряжения – совершенствование работы организации. В выдержку включают причины подготовки документа и саму констатирующую часть.

Образец составления бланка остается актуальным вне зависимости от вида приказа, на основании которого он создается. Важно отразить во вводной части полное наименование и реквизиты организации. Отличия будут только в основном тексте.

Могут ли отказать в предоставлении документа

Согласно норме, закрепленной в Трудовом кодексе, работодатель должен предъявлять документы, касающиеся деятельности сотрудника, по его письменному заявлению. Делается это в течение трех рабочих дней.

Важно! Основание для предоставления документа – часть 2 статьи 62 ТК РФ.

Составлять выдержку из приказа целесообразно по двум причинам – ввиду большого объема некоторых распоряжений и конфиденциальности данных. Хотя она готовится на основе приказа, она представляет собой отдельный документ. В нем указывают реквизиты предприятия и приводят пункт, который отвечает теме запроса. Далее можно скачать пример по ссылке бесплатно.

​

Выписка из приказа — образец

Post Views: 462

Делаем выписку из приказа об увольнении

Выписка из приказа об увольнении – образец приводится ниже – представляет собой выдержку из основного документа. Как оформляется выписка и что она должна содержать, расскажем в этой статье.

Как составить выписку из приказа об увольнении

Выписка из приказа об увольнении составляется на основании самого приказа, который в соответствии с Трудовым кодексом РФ (далее – ТК РФ) имеет унифицированную форму (№ Т-8).

Согласно условиям ст. 62 ТК РФ работодатель по заявлению сотрудника в течение 3 дней обязуется выдать ему копии документов, связанных с трудовой деятельностью сотрудника. С подобным требованием может также обращаться и уволенное лицо. А значит, вполне допускается выдача выписки из приказа об увольнении.

Унифицированной формы этого документа нет, однако она содержит в себе все сведения, прописанные в приказе об увольнении, но в сжатой форме.

Обычно в выписке нет части, описывающей причины увольнения. Указываются только итоговые сведения, то есть распорядительная часть приказа. Но по требованию сотрудника может быть воспроизведена и другая информация, содержащаяся в приказе об увольнении.

Необходимость в составлении подобной выписки может возникнуть при предъявлении документов в Пенсионный фонд или иные организации.

Основное назначение вышеуказанного документа — сокрытие конфиденциальной информации, т. к. сведения, содержащиеся в приказе об увольнении, относятся к персональным данным (ФЗ «О персональных данных» № 152-ФЗ).

Образец выписки приказа об увольнении

Выписка из приказа об увольнении оформляется на фирменном бланке предприятия.

Для того чтобы этот документ имел юридическую силу, необходимо соблюсти следующие требования по его содержанию:

1. Документ обязательно должен содержать наименование «Выписка» и дату.
2. Обязательно указание сведений о приказе, на основании которого составляется выписка, а именно даты и номера, а также Ф. И.О. уволенного сотрудника.
3. Текст выписки должен включать те сведения, которые необходимы лицу. Следует учесть тот факт, что если необходим полный текст приказа, выдается его копия. Необходимости в составлении выписки в этом случае нет.
4. Под текстом необходимо указать должность, фамилию и инициалы лица, подписавшего приказ об увольнении. Необходимости в проставлении на выписке подписи этого лица нет.
5. Выписку из приказа обязательно необходимо заверить, причем делать это нужно в том же порядке, что и заверение копии — по правилам п. 5.26 ГОСТ Р 7.0.97-2016. То есть проставить надпись «Верно», должность лица, составившего документ, его подпись, фамилию и инициалы, а также дату. Далее на документе ставится печать предприятия. Однако допустимо, что это будет печать отдела кадров.

Образец выписки можно скачать здесь: Образец выписки из приказа об увольнении. 

***

Выписка из приказа об увольнении составляется на бланке предприятия и содержит краткие сведения. Заверяется этот документ подписью лица, уполномоченного на подписание подобного рода документов, а также печатью предприятия. Выдать выписку необходимо в течение 3 дней с момента поступления соответствующего запроса.

Выписка из приказа об увольнении: образец

Ст. № 62 ТК РФ устанавливает обязательство организаций за три дня по заявлению трудоустроенных лиц выдавать копии документов и справок. С такими просьбами могут обращаться и рассчитавшиеся граждане. Поэтому, разрешается выдача выписок из приказов об увольнении.

Что такое выписка из приказа об увольнении

Выписка включает отдельные положения приказа, необходимые заявителю. Обычно, она состоит из одного пункта. Выписка из приказа об увольнении может касаться исключительно конкретного рассчитавшегося сотрудника, а не всех перечисленных в документе лиц.

Основной целью издания выписки выступает сокрытие конфиденциальной информации. Ведь при увольнении может использоваться один приказ на несколько сотрудников. А данные о них не могут предоставляться сторонним лицам. Именно в таких случаях кадровик составляет выписку, а не делает заверенную копию.

Запрашивается подобная документация для обращения в ПФ либо другие необходимые инстанции.

Специальной формы по закону выписка из приказа об увольнении не имеет. Но, готовится она в соответствии с основными правилами делопроизводства.

Как заполняется выписка из приказа об увольнении, образец

Печатается выписка на специальном бланке предприятия. В ней должны присутствовать обязательные пункты. Образец выписки из приказа об увольнении должен содержать:

• Название и дата.
• Обозначение реквизитов приказа, на основании которого составляется выписка.
• Ф. И. О. и должность уволенного лица.
• Виза и данные лица, подписавшего приказ.

Важно! Выписка содержит исключительно данные, требуемые заявителю. Если нужна вся информация из приказа и в нем не указаны конфиденциальные данные, целесообразнее запрашивать копию приказа.

Выписка обязательно заверяется. Для этого проставляется слово «верно», прописывается должность, фамилия, инициалы, дата и подпись ответственного лица. Дополнительно ставится печать.

Образец выписки из приказа об увольнении можно скачать ниже.

Выписки из приказов об увольнении оформляются кадровыми специалистами на заранее подготовленных бланках организации. Документ содержит краткие сведения, необходимые заявителю. Также выписка подлежит обязательному заверению ответственным лицом и печатью. Выдать документ работодатель должен обратившемуся лицу в течение трех дней после подачи заявления.

Образец выписки из кадрового приказа

В кадровую службу от руководителя организации поступило задание: сделать выписку из приказа о приеме на работу главного бухгалтера. Срочно нужен образец выписки, ведь задание нужно выполнить в кратчайшие сроки. Подскажем кадровику, как правильно ее оформить.

Право на выписки

Помимо заверенных копий кадровых приказов и других документов, связанных с работой, сотрудникам предприятия могу понадобиться выписки из них. Право работников на такие выписки обусловлено прямой нормой законодательства (ст. 62 ТК РФ). Вообще, на подготовку такой выписки дается три рабочих дня с момента поступления заявления от работника (п. 7 Правил, утв. постановлением Правительства РФ от 16.04.2003 № 225). Однако, если распоряжение поступило напрямую от директора, лучше не тянуть до последнего.

Итак, выписка из приказа о приеме на работу – это документ, содержащий текст или часть текста, который находится в подлиннике. Такая выписка равносильна заверенной копии. Конечно, сделать и заверить копию подчас проще, но часто имеет смысл делать именно выписку из приказа. Например, чтобы сохранить конфиденциальную информацию о других сотрудниках. Если бы пришлось копировать весь документ целиком, то эти сведения стали бы достоянием персонала.

Образец выписки из приказа о приеме

Выписка из приказа включает в себя название, собственно текст оригинального приказа, заверительную надпись и подпись работника, ответственного за заверение. Если у организации есть собственные фирменные бланки, то выписку из приказа надо оформить именно на таком бланке. Такая норма предусмотрена, действующим до настоящего времени п.1 Указа Президиума ВС СССР от 04.08.1983 №9779-X). Так выглядит образец выписки из приказа о приеме:

Выписку из приказа заверяем правильно и в срок

Действующее законодательство предусматривает единый порядок заверения документов (п. 3.26 ГОСТ Р 6.30-2003, утв. постановлением Госстандарта России от 03.03.2003 № 65-ст). Так, после текста приказа о приеме на работу делается надпись «Верно» и указываются фамилия, имя, отчество, а также должность компетентного лица, имеющего полномочия заверять выписки. Ставиться его подпись и печать организации (при ее наличии).

Образец приказа на отпуск 2020 и 2021

Приказ о предоставлении отпуска работнику — это распорядительный акт локального значения, в котором обозначаются даты и продолжительность отдыха сотрудника, а также условия его замены на период отсутствия, если это предусмотрено рабочим процессом.

Право на отдых записано не только в Конституции РФ, но и в Трудовом кодексе. Каждый трудоустроенный гражданин имеет законное право отдохнуть минимум 28 дней в году за счет своего работодателя. Такой отдых называется ежегодным оплачиваемым отпуском, и чтобы он наступил, и работник, и работодатель должны составить несколько важных документов. Одним из них является приказ о предоставлении отпуска. Рассмотрим подробнее, как оформить этот документ.

Приказ об отпуске (образец рассмотрим ниже) является одним из наиболее часто используемых документов в работе специалиста по кадрам. Ведь законный отдых работников разрешается дробить на части, в результате чего один работник может отдыхать несколько раз за год. И каждый раз нужно составлять новый локальный акт. Поэтому умение правильно составить этот документ и знание всех нюансов и «подводных камней» в оформлении ежегодного отпуска существенно облегчает работу кадровиков. На самом деле в составлении этого локального акте нет никакой сложности.

Формы приказа о предоставлении ежегодного основного оплачиваемого отпуска

По нормам статьи 123 ТК РФ, основанием для предоставления работнику дней отдыха являются график отпусков (как его разработать и утвердить, мы уже рассказывали в другой статье), а также заявление работника (в случае отдыха вне графика, за работу в выходные дни, донорство и т. п.). Только при наличии этих документов можно приступать к составлению самого распоряжения. Для этого можно применить как унифицированную форму (их есть две: для одного работника и сразу для нескольких), так и самостоятельно разработанный шаблон. Это связано с тем, что Постановление Госкомстата России от 05.01.2004 № 1, которым утверждены унифицированные бланки, является не обязательным нормативно-правовым актом, а всего лишь рекомендовано к применению. Поэтому, если работодатель захочет написать документ в произвольном порядке, никто его за это наказывать не будет. Главное, чтобы в таком документе были все обязательные реквизиты. Кроме того, разработанная форма должна содержаться в учетной политике организации, ведь она будет служить основанием для выплаты отпускных.

Итак, унифицированных форм две:

• № Т-6 — на одного работника;
• № Т-6а — на нескольких работников.

Первая из них используется кадровиками чаще, потому что даже если отдыхать отправляются сразу несколько человек, бывает удобно оформить документы на каждого из них в отдельности. Причин для этого много, в том числе не надо сбрасывать со счетов защиту персональных данных, если речь идет, например, о лицах, которые работают в разных подразделениях организации. Скачать бесплатно бланк приказа на отпуск можно в конце статьи.

Что нужно обязательно указать в приказе

Вне зависимости от того, на унифицированном или разработанном самостоятельно бланке будет оформлен этот кадровый локальный акт, у него обязательно должны быть порядковый номер и дата составления. Кроме того, предусмотрены обязательные реквизиты:

• наименование организации-работодателя;
• Ф.И.О. лица, которое уходит отдыхать;
• вид отпуска (основной ежегодный, дополнительный и т. п.), их может быть несколько;
• период работы, за который предоставлен отдых;
• даты начала и окончания отпускного периода и его продолжительность;
• подпись и данные руководителя организации.

Если с большинством информации, обязательной к заполнению, все более-менее понятно, то возникает вопрос, что считать периодом работы. Таким периодом всегда является рабочий год. Например:

Кошкин Марат Сергеевич устроился в ООО «ВЕСНА» на работу 01.06.2018. Ежегодный отпуск по графику ему предоставлен летом: с 20.07 по 02.08.2019, продолжительностью 14 календарных дней. Однако в приказе все равно следует отразить, что отдых предоставляется работнику за период работы с 01.06.2018 по 31.05.2019. А вот следующий период, за который работнику будут положены дни отпуска, начнется уже с 01.06.2019.

Оформление формы № Т-6 будет отличаться от формы № Т-6а только количеством отпускников. Обязательные реквизиты и требования к заполнению не изменяются.

Блоки «А» и «Б»

Рассмотрим внимательно образец приказа на ежегодный оплачиваемый отпуск, составленный по форме № Т-6.

После данных о периоде работы стоят загадочные буквы «А» и «Б». Это так называемые блоки, в которых указывается тип отдыха.

1. Блок А — это ежегодный основной оплачиваемый отдых — время, которое работодатель обязан предоставить ежегодно всем сотрудникам организации, без исключения.
2. Блок Б — это все остальные виды отдыха: ежегодный дополнительный или учебный отпуск, выходные дни без сохранения заработной платы, декрет и даже время, которое дается для ухода за ребенком до трех лет.

В этих блоках необходимо указать количество календарных дней отдыха сотрудника и даты, на которые он приходится. Если в форме говорится только об основном отдыхе, заполнять блок Б работодателю не нужно. В случае с несколькими видами заполняются оба блока. Если речь не идет об обычных оплачиваемых отпускных днях, нужно заполнить только блок Б.

Образец приказа на отпуск 2020 без сохранения зарплаты

Подписываем и знакомим

Подписать кадровый акт может руководитель организации или уполномоченное на это иное должностное лицо. Когда приказ готов, с ним нужно ознакомить сотрудника под подпись. Подпись нужно обязательно расшифровать. Если сотрудник от этой процедуры отказался, то работодателю придется подготовить соответствующий акт. Даже если встретиться лично с работником невозможно, например, он работает дистанционно, то его все равно нужно ознакомить с приказом. Сделать это можно в режиме обмена электронными документами с цифровыми подписями. Такой порядок предусмотрен статьей 312.1 ТК РФ.

Директор тоже хочет отдыхать

Как быть, если отдохнуть решил сам директор компании? Тоже нужно все оформить в соответствии с законодательством. Руководитель организации одновременно является ее работником. При этом, в силу Федерального закона от 08.02.1998 № 14-ФЗ и Федерального закона от 26.12.1995 № 208-ФЗ, он имеет статус единоличного исполнительного органа. Но отправить сам себя отдыхать права все равно не имеет, если не включен в график. В уставе организации должно быть записано, кто может принять такое решение: только коллегиальный орган (правление, дирекция и др.), при его наличии, собрание участников (акционеров) общества или сам руководитель. Решение коллегиального органа или собрания участников оформляется протоколом, в котором, кроме всех условий для отдыха директора, решается также вопрос о том, кто будет исполнять его обязанности на время отсутствия.

На основании такого протокола издается приказ. Он также может быть составлен в любой форме: как в унифицированной, так и в произвольной.

Если выбрана унифицированная форма Т-6, то ее по умолчанию может подписать только сам руководитель. Поэтому, чтобы свою подпись смог поставить уполномоченный на это участник общества, в нее нужно заранее внести изменения.

Факт таких изменений фиксируется отдельным приказом произвольной формы. Бывает, что у директора есть по уставу полномочия отправить себя в отпуск самостоятельно. Тогда он может подписать приказ сам, а все оформление провести в соответствии с общими нормами ТК РФ.

Образец приказа на ежегодный оплачиваемый отпуск директора

Материалы по теме

Обязательный отдых за прошлые годы

Бывает так, что сотрудник не отдыхал несколько лет, а в текущем году решил воспользоваться днями отдыха за прошлые периоды. В этом случае это обязательно нужно отразить в локальном акте № Т-6 или № Т-6а. Правда, обычный бланк не предусматривает перечисления нескольких периодов, поэтому его нужно доработать. Изменения обязательно должны быть оформлены соответствующим организационно-распорядительным документом, как предусмотрено Порядком применения унифицированных форм первичной учетной документации. В этом случае самостоятельно разработанный бланк предпочтительнее, так как он не требует дополнительных процедур.

Срок хранения

После того как оформление закончено, документ нужно подшить в папку и отправить на хранение. Пунктом 19 Перечня типовых управленческих архивных документов, утвержденного Приказом Минкультуры РФ от 28.08.2010 № 558, срок хранения таких локальных актов составляет 5 лет. Однако если сотрудники, которые ушли отдыхать, заняты на тяжелых, вредных или опасных работах или документ касается предоставления дней без сохранения содержания (заработной платы), то, в соответствии с пунктом 19 Перечня, такой локальный акт придется хранить 75 лет.

Приказ на отпуск, образец 2020

Приказ отпуск за свой счет, образец Т-6

Приказ на отпуск без сохранения заработной платы, образец 2020

Образец приказа на отпуск директору 2020

Подробнее об ОТПУСКНЫХ

• рекомендации и помощь в решении вопросов
• нормативные документы
• формы и образцы их заполнения

Правовые документы

Извлечение ДНК – Science Learning Hub

Извлечение ДНК – это обычная процедура, используемая для выделения ДНК из ядра клеток.

Ученые могут купить готовые наборы для выделения ДНК. Эти наборы помогают извлекать ДНК из определенных типов клеток или типов образцов. Однако их обычное использование может быть дорогостоящим, поэтому многие лаборатории имеют свои собственные методы выделения ДНК

Что включает в себя выделение ДНК?

Шаг 1. Разрушение клеток для высвобождения ДНК

Клетки в образце отделяются друг от друга, часто физическими средствами, такими как измельчение или встряхивание, и помещаются в раствор, содержащий соль.Положительно заряженные ионы натрия в соли помогают защитить отрицательно заряженные фосфатные группы, которые проходят вдоль основной цепи ДНК.

Затем добавляется моющее средство. Детергент расщепляет липиды клеточной мембраны и ядер. ДНК высвобождается, когда эти мембраны разрушаются.

Шаг 2. Отделение ДНК от белков и другого клеточного мусора

Чтобы получить чистый образец ДНК, необходимо удалить как можно больше клеточного мусора. Это можно сделать разными способами.Часто протеаза (белковый фермент) добавляется для разрушения ДНК-ассоциированных белков и других клеточных белков. В качестве альтернативы, часть клеточного мусора может быть удалена путем фильтрации образца.

Шаг 3. Осаждение ДНК спиртом

Наконец, к образцу ДНК осторожно добавляют ледяной спирт (этанол или изопропанол). ДНК растворима в воде, но не растворяется в присутствии соли и спирта. При осторожном перемешивании спиртового слоя стерильной пипеткой становится видимым осадок, который можно слить.Если ДНК много, вы можете увидеть вязкий белый осадок.

Шаг 4. Очистка ДНК

Теперь образец ДНК можно дополнительно очистить (очистить). Затем его ресуспендируют в слабощелочном буфере и готово к использованию.

Шаг 5. Подтверждение наличия и качества ДНК

Для дальнейшей лабораторной работы важно знать концентрацию и качество ДНК.

Показания оптической плотности, снятые спектрофотометром, можно использовать для определения концентрации и чистоты ДНК в образце.В качестве альтернативы можно использовать гель-электрофорез, чтобы показать присутствие ДНК в вашем образце и дать представление о его качестве.

Для чего можно использовать эту ДНК?

После извлечения ДНК можно использовать для молекулярных анализов, включая ПЦР, электрофорез, секвенирование, снятие отпечатков пальцев и клонирование.

Как из образца извлекается ДНК?

На протяжении многих лет тесты ДНК постоянно совершенствовались до такой степени, что люди, не выходя из дома, могли предоставить образец, который лаборанты могут использовать для составления подробного отчета о своем геноме.С помощью небольшого образца крови, слюны, клеток щек или волосяного фолликула вы сможете лучше понять свое тело и его потребности.

Когда вы используете ДНК-тест, вы предоставляете образец крови или слюны. Как только этот образец поступает в лабораторию, техники извлекают из него ДНК. Известный как экстракция ДНК, это процесс, с помощью которого ДНК выделяется из ядра клетки. Помимо тестирования ДНК, экстракция ДНК также используется для обнаружения бактерий или вирусов в окружающей среде.

Существует ряд методов выделения ДНК.Например, молекулярный метод FISH (флуоресцентная гибридизация in situ) используется для идентификации и классификации конкретных бактериальных групп, тогда как секвенирование выполняется для сравнения частей или целых геномов с существующей последовательностью в общедоступной базе данных.

Пять шагов для извлечения ДНК

Хотя существуют наборы для экстракции ДНК, которые извлекают ДНК из типов клеток, они могут быть дорогими, поэтому большинство ученых и лабораторий разрабатывают свои собственные методы извлечения ДНК.Несмотря на то, что могут быть небольшие отклонения, существуют общие шаги, которым следуют лаборатории для извлечения ДНК из вашего образца.

Шаг 1: Сначала техники вскрывают клетки в вашем образце, чтобы высвободить ДНК. Этот процесс известен как лизинг, поскольку лизины используются для растворения клеток. Чтобы отделить клетки в вашем образце, техники измельчат их и добавят в солевой раствор. Положительно заряженные ионы натрия в соли помогают защитить фосфатные группы, которые находятся в основе ДНК, поскольку они заряжены отрицательно.После этого добавляется детергент, такой как SDS (додецилсульфат натрия), для удаления липидов с клеточной мембраны и ядер. Когда эти мембраны разрушаются, высвобождается ДНК.

Шаг 2: Затем ДНК необходимо отделить от белков. Этот клеточный мусор может затруднить получение точного считывания ДНК, поэтому технические специалисты стремятся получить как можно более чистый образец ДНК. Есть несколько разных способов удалить клеточный мусор и белки. Один из методов осаждения белка – это добавление аммония, ацетата натрия или другой соли.Белки можно удалить путем перемешивания с фенол-хлороформом и центрифугирования. В качестве альтернативы к образцу можно добавить белковый фермент для разложения любых белков.

Шаг 3: После получения чистого образца ДНК технические специалисты добавляют ледяной этанол или изопропанол. Хотя ДНК растворима в воде, она не растворяется в присутствии соли или спирта. Спирт помогает промыть образец и удалить ранее добавленную соль. Когда они перемешивают спирт в образце, появляется белый вязкий осадок (представьте слюну в стакане воды), и его можно извлечь.

Шаг 4: После извлечения образца ДНК технические специалисты проведут дополнительную очистку и очистку. После очистки он ресуспендируется в слабощелочном буфере, таком как Трис, и готов к использованию.

Шаг 5: Даже когда он готов к использованию, техническим специалистам все равно необходимо определить качество и концентрацию ДНК. Например, если извлечено недостаточно ДНК, может потребоваться дополнительный тампон. Используя спектрофотометр, техники для чтения оптической плотности, техники могут подтвердить присутствие ДНК.В качестве альтернативы вместо измерения оптической плотности техники могут использовать гель-электрофорез для определения присутствия ДНК.

После того, как технический персонал извлечет чистый образец ДНК из вашего тампона, он сможет проанализировать вашу ДНК по ряду факторов. Хотя 99,9% ДНК двух людей будут идентичны, эти 0,1% различаются, и именно это делает нас уникальными. Это генетические маркеры, на которые ученые обращают внимание при проведении ДНК-теста.

ДНК-тестирование может выявить вашу генетическую принадлежность, факторы риска и потенциальные заболевания, которые вы могли унаследовать (или в конечном итоге унаследовать) от своих родителей, помочь вам сбросить вес и многое другое.И, как мы все видели в криминальных сериалах, образцы ДНК также можно использовать для помощи на местах преступлений и на судебных процессах, поскольку отпечатки пальцев и образцы крови могут использоваться для определения жертвы и преступника.

В OmeCare мы предлагаем ряд тестов ДНК, ориентированных на ваше здоровье. От понимания вашего рациона питания и физических упражнений до скрининга на потенциальные гены рака – ДНК-тестирование может дать вам возможность принимать обоснованные решения о своем здоровье. С помощью небольшого образца ДНК вы можете узнать о своем здоровье и теле то, чего никогда не знали.

Основы экстракции ДНК – Виртуальный учебник Alaska BioPREP

Вы, наверное, слышали о Генетическом коде или Плане жизни; эти термины относятся к ДНК. Все живые существа, включая животных, растения и бактерии, имеют ДНК в своих клетках. ДНК – это очень длинная молекула, состоящая из цепочки нуклеотидов, и порядок этих нуклеотидов – это то, что делает организмы похожими на других представителей своего вида и в то же время разными индивидуумами. Гены – это участки в этой длинной молекуле ДНК.

Чтобы изучить ДНК, сначала нужно получить ее из клетки. В эукариотических клетках, таких как клетки человека и растения, ДНК организована в виде хромосом в органелле, называемой ядром. Бактериальные клетки не имеют ядра. Их ДНК организована в кольца или кольцевые плазмиды, которые находятся в цитоплазме. Процесс извлечения ДНК освобождает ДНК из клетки, а затем отделяет ее от клеточной жидкости и белков, так что у вас остается чистая ДНК.

Три основных этапа экстракции ДНК: 1) лизис, 2) осаждение и 3) очистка.

Шаг 1: Лизис
На этом этапе клетка и ядро ​​раскрываются, чтобы высвободить ДНК внутри, и есть два способа сделать это. Во-первых, механическое разрушение открывает клетки. Это можно сделать с помощью гомогенизатора тканей (например, небольшого блендера), ступки и пестика или разрезав ткань на мелкие кусочки. Механическое разрушение особенно важно при использовании растительных клеток, поскольку они имеют прочную клеточную стенку. Во-вторых, для лизиса используются детергенты и ферменты, такие как протеиназа К, для освобождения ДНК и растворения клеточных белков.

Этап 2: Осаждение
По завершении этапа лизиса ДНК была освобождена от ядра, но теперь она смешана с размельченными частями клетки. Осаждение отделяет ДНК от клеточного мусора. Во-первых, ионы Na + (натрия) нейтрализуют отрицательные заряды на молекулах ДНК, что делает их более стабильными и менее растворимыми в воде. Затем добавляется спирт (например, этанол или изопропанол), который вызывает осаждение ДНК из водного раствора, поскольку он не растворяется в спирте.

Этап 3. Очистка
Теперь, когда ДНК отделена от водной фазы, ее можно промыть спиртом для удаления всех оставшихся нежелательных материалов и клеточного мусора. На этом этапе очищенную ДНК обычно повторно растворяют в воде для облегчения обращения и хранения.

Целевые ожидаемые уровни успеваемости на Аляске
[9] SC1.1 Учащийся демонстрирует понимание того, как наука объясняет изменения в формах жизни с течением времени, включая генетику, наследственность, процесс естественного отбора и биологическую эволюцию, признавая, что все организмы имеют хромосомы сделаны из ДНК, и эта ДНК определяет черты.

Извлечение ДНК | Давайте поговорим о науке

AB Биология 30 (2007 г., обновлено 2014 г.) 12 Блок C: Отделение клеток, генетика и молекулярная биология

AB Наука о знаниях и трудоустройстве 10-4 (2006) 10 Модуль C: Исследование материи и энергии в живых системах

AB Наука о знаниях и трудоустройстве 8, 9 (пересмотрено в 2009 г.) 8 Блок B: клетки и системы

AB Наука 10 (2005 г., обновлено в 2015 г.) 10 Блок C: Круговорот материи в живых системах

AB Наука 14 (2003 г., обновлено 2014 г.) 10 Модуль C: Исследование материи и энергии в живых системах

AB Наука 24 (2003 г., обновлено 2014 г.) 11 Блок C: Защита от болезней и здоровье человека

AB Наука 30 (2007 г., обновлено 2014 г.) 12 Блок A: Живые системы реагируют на окружающую их среду

AB Наука 7-8-9 (2003 г., обновлено в 2014 г.) 8 Блок B: клетки и системы

до н.э Анатомия и физиология 12 (июнь 2018 г.) 12 Большая идея: экспрессия генов посредством синтеза белка – это взаимодействие между генами и окружающей средой.

до н.э Science Grade 10 (март 2018 г.) 10 Большая идея: ДНК – это основа разнообразия живых существ.

до н.э Естественные науки 8 класс (июнь 2016 г.) 8 Большая идея: жизненные процессы происходят на клеточном уровне.

МБ 12 класс биологии (2011) 12 Блок 2: Механизмы наследования

МБ Естественные науки 8 класс (2000 г.) 8 Кластер 1: клетки и системы

NB Biologie 53411/53412, 12e année (2008) (только на французском) 12 3. Клетки

NB Биология 112/111 (2008) 11 Блок 1: Клетка

NB Биология 122/121 (2008) 12 Блок 1: Генетическая преемственность

NB Естественные науки 8 класс (2002) 8 Клетки, ткани, органы и системы

NB Science et technologies 8e année (2011 г.) (только на французском языке) 8 L’Univers non vivant: La Terre

NL Биология 3201 (2004) 12 Блок 3: Генетическая преемственность

NL 8 класс естествознания 8 Блок 4: Клетки, ткани, органы и системы

NS Биология 12 (2000) 12 Блок 3: Генетическая преемственность

NS Структура результатов обучения: естественные науки 8 класс (2014 г.) 8 Науки о жизни: клетки, ткани, органы и системы

NT Биология 30 (Альберта, 2007 г., обновлено 2014 г.) 12 Блок C: Отделение клеток, генетика и молекулярная биология

NT Наука о знаниях и трудоустройстве 10-4 (Альберта, 2006 г.) 10 Модуль C: Исследование материи и энергии в живых системах

NT Наука о знаниях и возможностях трудоустройства 8 (Альберта, редакция 2009 г.) 8 Блок B: клетки и системы

NT Наука 10 (Альберта, 2005 г., обновлено в 2015 г.) 10 Блок C: Круговорот материи в живых системах

NT Наука 14 (Альберта, 2003 г., обновлено 2014 г.) 10 Модуль C: Исследование материи и энергии в живых системах

NT Наука 24 (Альберта, 2003 г., обновлено 2014 г.) 11 Блок C: Защита от болезней и здоровье человека

NT Наука 30 (Альберта, 2007 г., обновлено 2014 г.) 12 Блок A: Живые системы реагируют на окружающую их среду

NT Наука 8 (Альберта, 2003 г., обновлено в 2014 г.) 8 Блок B: клетки и системы

НУ Биология 30 (Альберта, 2007 г., обновлено 2014 г.) 12 Блок C: Отделение клеток, генетика и молекулярная биология

НУ Наука о знаниях и трудоустройстве 10-4 (2006) 10 Модуль C: Исследование материи и энергии в живых системах

НУ Наука о знаниях и возможностях трудоустройства 8 (Альберта, редакция 2009 г.) 8 Блок B: клетки и системы

НУ Наука 10 (2005 г., обновлено в 2015 г.) 10 Блок C: Круговорот материи в живых системах

НУ Наука 14 (2003 г., обновлено 2014 г.) 10 Модуль C: Исследование материи и энергии в живых системах

НУ Наука 24 (Альберта, 2003 г., обновлено 2014 г.) 11 Блок C: Защита от болезней и здоровье человека

НУ Наука 30 (Альберта, 2007 г., обновлено 2014 г.) 12 Блок A: Живые системы реагируют на окружающую их среду

НУ Наука 8 (Альберта, 2003 г., обновлено в 2014 г.) 8 Блок B: клетки и системы

НА Биология, 11 класс, Колледж (SBI3C) 11 Strand D: Генетика

НА Биология, 11 класс, Университет (SBI3U) 11 Строка D: генетические процессы

НА Биология, 12 класс, Университет (SBI4U) 12 Нить D: молекулярная генетика

НА Наука и технологии, 1–8 классы (2007 г.) 8 Клетки

НА Естественные науки, академический класс 10 (SNC2D) 10 Нить B: ткани, органы и системы живых существ

НА Прикладная наука 10 класс (SNC2P) (2008) 10 Нить B: ткани, органы и системы человека

НА Естественные науки, 12 класс, университет / колледж (SNC4M) 12 Strand F: Биотехнологии

PE Зоотехния 801A / 621A (2012) 11 Генетика и размножение

PE Биология 621A (2010) 12 Генетическая преемственность

PE Science 421A (проект, 2018 г.) 10 СК 1.1 Объясните, почему клетка считается живой системой и отвечает за непрерывность и разнообразие жизни.

PE Science 7e année (2016) (только на французском) 7 Тема 2: L’univers vivant – Тема A: Les caractéristiques des espèces

PE Естественные науки 8 класс (в редакции 2016 г.) 8 Блок 4: Клетки, ткани, органы и системы

КК Наука и технология Секция I Живой мир: разнообразие форм жизни

КК Наука и технология Секция I Живой мир: процессы поддержания жизни

КК Наука и технология Раздел II Живой мир: разнообразие форм жизни

КК Наука и технология Раздел II Живой мир: процессы поддержания жизни

SK Биология 30 (2016) 12 Генетика и биотехнология

SK Естественные науки 8 класс (2009 г.) 8 Науки о жизни – клетки, ткани, органы и системы (CS)

YT Анатомия и физиология 12 (Британская Колумбия, июнь 2018 г.) 12 Большая идея: экспрессия генов посредством синтеза белка – это взаимодействие между генами и окружающей средой.

YT Science Grade 10 (Британская Колумбия, июнь 2016 г.) 10 Большая идея: ДНК – это основа разнообразия живых существ.

YT Science Grade 8 (Британская Колумбия, июнь 2016 г.) 8 Большая идея: жизненные процессы происходят на клеточном уровне.

Все об обработке заказов на продажу

Если ваша компания небольшая, автоматизированная обработка заказов на продажу может оказаться излишней. Пока объем вашего заказа остается небольшим, а выбор продуктов остается ограниченным, вы можете обойтись стандартными формами.

В идеале вам понадобится форма, которую можно редактировать, настраивать и печатать. Мы создали для вас шаблон заказа на продажу. В этом шаблоне, организованном для физических товаров, есть поля для записи сведений о покупателе, продавце, продукте, количестве, цене и т. Д.

Загрузить шаблон заказа на продажу – Excel

Excel | Smartsheet

Вы также можете найти типовые формы в офисах канцелярских товаров. Убедитесь, что они отформатированы с учетом важной информации:

• Информация о продавце: Номер заказа на продажу, идентификационные коды продуктов, название компании, адрес, телефон, номер клиента, продавец и утверждающий (при необходимости)
• Информация о покупателе: Имя, адрес, контактная информация, номер заказа на поставку и разрешение
• Информация о транзакции: Название продукта, количество, цена за единицу, расширенная цена, промежуточный итог, дата заказа, дата доставки, способ доставки, налоги, стоимость доставки и условия, включая способ оплаты и то, подлежит ли оплате остаток или требуется залог или частичная оплата

Как создать собственную форму заказа на продажу в Excel

В конечном итоге вы можете предпочесть составить собственную форму заказа на продажу.Следуйте этим пошаговым инструкциям, чтобы создать форму заказа в Excel.

1. Создайте книгу: Откройте Excel и создайте новую книгу. Дважды щелкните Sheet1 и назовите его Order Form . Затем щелкните + на вкладке рядом с Sheet1, чтобы открыть Sheet2 . Дважды щелкните Sheet2 и назовите его Products .

2. Составьте список продуктов или услуг: Создайте справочную таблицу для продуктов и цен.

• Создать список:

  • Щелкните лист Products и назовите ячейку A1 Product и ячейку B1 Price .
  • Введите продукты и их цены.

• Форматировать в виде таблицы:

  • Щелкните любую ячейку в списке продуктов. Щелкните вкладку Home на ленте Excel.
  • Щелкните Форматировать как таблицу и выберите стиль таблицы.

• Проверьте ассортимент по таблице продуктов. В этом примере диапазон составляет $ A $ 1: $ B $ 5. Знак «$» перед каждой буквой и цифрой гарантирует, что Excel закрепит ваш выбор в таблице и не переместит его относительно положения других ячеек, использующих данные.
• Установите флажок В моей таблице есть заголовки и нажмите OK.

• Когда вы выбираете ProductList из раскрывающегося списка над столбцом A, Excel автоматически выделяет ячейки в этом списке.

3. Назовите всю таблицу: Выберите ячейки для вашей таблицы (без заголовков) в столбцах A и B. В этом примере выбраны ячейки A2: B5.

• Введите заголовок из одного слова (в данном примере это ProductTable ) в строке над столбцом A.

4. Начало формы заказа: Щелкните вкладку Форма заказа и введите заголовок Форма заказа в ячейку B2.Отформатируйте шрифт и размер, используя раскрывающиеся меню на вкладке «Главная». Затем сделайте следующее:

• Установите для столбца A ширину 1,00.
• Введите = СЕГОДНЯ () в ячейку E2, чтобы указать текущую дату.
• Щелкните правой кнопкой мыши ячейку E2 и выберите Форматировать ячейки . (В нашем примере используется формат Месяц-День-Год.)
• В ячейках с B9 по E9 введите заголовки столбцов Продукт, Цена, Количество и Итого соответственно. Установите форматы ячеек в этих столбцах: «Общий», «Учет», «Число» и «Учет» соответственно.
• Выберите ячейки от B9 до E18 и щелкните значок Borders на ленте вкладки Home . Затем щелкните All Borders .
• Уменьшите высоту и ширину окружающих столбцов и строк для привлекательности формы. В этом примере уменьшена высота строк 1, 3 и 8.

5. Создание раскрывающихся списков для продуктов: Создавайте раскрывающиеся списки на листе формы заказа, чтобы легко вводить продукт.

• Выберите ячейки B10: B18 в форме заказа и щелкните Data в меню.

• В раскрывающемся меню Разрешить выберите Список . Щелкните поле Источник, введите = ProductList и щелкните OK . Этот шаг ограничивает записи (и способ их написания), чтобы они соответствовали списку продуктов, который вы уже создали.

6. Создайте поиск цены: Введите следующую формулу в ячейку C10, чтобы получить цену продукта:

= ЕСЛИ (B10 = “”, “”, ВПР (B10, ProductTable, 2, FALSE))

Нажмите Введите на клавиатуре.

В этой формуле используются функции ВПР и ЕСЛИ . Разбивая эту формулу:

• IF просматривает ячейку продукта и, если эта ячейка пуста, возвращает пустую строку «», поэтому ячейка цены выглядит пустой.
• ВПР ищет продукт в таблице продуктов (ProductTable).
• Если товар есть, формула возвращает точную цену (ЛОЖЬ), которая находится во втором столбце (2).

Скопируйте ячейку C10 и вставьте ее в оставшуюся часть столбца C.Это гарантирует, что каждая ячейка в столбце C будет просматривать предыдущую ячейку в столбце B для сравнения с таблицей продуктов.

Чтобы проверить эту формулу, выберите продукт из раскрывающегося списка и введите его в ячейку B10. Должны выполняться два условия:

1. B10 позволит загружать в ячейку только продукт из списка продуктов.
2. Цена должна автоматически отображаться в ячейке C10.

7.Сгенерируйте итог для строки: В ячейке E10 введите следующую формулу:

= ЕСЛИ (C10 = “”, “”, C10 * D10)

Нажмите Введите на клавиатуре.

В этой формуле используются функция ЕСЛИ и функции простого умножения:

• IF просматривает ячейку с ценой и, если эта ячейка пуста, возвращает пустую строку «», поэтому итоговая ячейка выглядит пустой. Если в ячейке цены что-то есть, но в ячейке количества ничего нет, в итоговой ячейке будет $ -. Чтобы заполнить строку, покупатель должен ввести количество.
• Простое умножение между ценой и количеством.

Скопируйте ячейку E10 и вставьте формулу в ячейки E11: E18.

Чтобы проверить эту формулу, введите количество продукта, указанное в ячейке B10. Сумма для этого продукта и количества должна быть рассчитана в ячейке.

8. Подсчет суммы заказа: Используйте функцию СУММ для суммирования соответствующих строк в Форме заказа. Например, вы хотите знать общее количество заказанных продуктов и общую стоимость.На листе формы заказа введите в ячейку D19 следующую формулу:

= СУММ (D10: D18)

Нажмите Введите на клавиатуре.

Эта формула суммирует количество ячеек. Скопируйте ячейку D19 и вставьте ее в ячейку E19 для получения общей стоимости формы заказа.

9. Добавьте необязательный список клиентов: При желании вы можете добавить лист с информацией о клиенте, используя навыки, полученные в этом разделе. Когда вы выбираете имя клиента в форме заказа, детали будут заполнены автоматически.

• Выберите стиль и выберите Введите на клавиатуре.
• Выберите первый столбец (полное имя) в таблице без заголовка (A1) и введите CustomerList в поле над столбцом A, чтобы присвоить ему имя.
• Выберите всю таблицу без заголовков (строка 1) и назовите ее CustomerTable в поле над столбцом A.

На рабочем листе Форма заказа создайте пространство для ввода имени клиента, введя Кому: в ячейку B4.Выберите ячейку B5, щелкните Data Validation на вкладке Data и во всплывающем окне под Allow выберите List. В поле источника во всплывающем окне введите = CustomerList .

Это ограничивает имя клиента, введенное в ячейку B5, тем, что указано в листе CustomerList.

• Поместите рамку вокруг ячеек B5: B7.
• В ячейке B6 введите следующую формулу:

= ЕСЛИ (B5 = “”, “”, ВПР (B5, CustomerTable, 2, FALSE))

• В ячейке B7 введите эту формулу, чтобы найти город, штат и почтовый индекс:

= ЕСЛИ (B5 = “”, “”, ВПР (B5, CustomerTable, 3, FALSE) & “,” & VLOOKUP (B5, CustomerTable, 4, FALSE) & “” & ВПР (B5, CustomerTable, 5, FALSE) )

Чтобы проверить эту формулу, введите имя клиента из раскрывающегося меню в ячейку B5.Ячейки B6 и B7 должны автоматически обновляться, чтобы отображать адрес, город, штат и почтовый индекс.

Экстракция Сокслета – обзор

3.28.3.1.1 Процедуры, основанные на экстракции растворителем (в сочетании с разделением жидкости или SPE)

Экстракция Сокслета – это классический метод экстракции для сложных твердых матриц, хотя в настоящее время он не получил широкого распространения из-за его недостатки; он требует времени (от 6 до 24 часов) и растворителя (250–700 мл), а также обеспечивает постоянное нагревание колбы, в которой остаются экстрагированные пестициды.Тем не менее, метод Сокслета по-прежнему является первым выбором, когда пестициды извлекаются из фильтров и картриджей, используемых в активных пробоотборниках воздуха, или из почвы, отложений и шламов, потому что он имеет то преимущество, что является простым и дешевым методом, и он был принят. в некоторых стандартных аналитических методиках определения пестицидов в атмосферном воздухе. Экстракция по Сокслету выполняется с помощью различных смесей растворителей, таких как гексан / дихлорметан, дихлорметан / легкий петролейный эфир, циклогексан / ацетон или гексан / ацетон, или даже метанол, в зависимости от природы образца и пестицидов, используемых в аналитическом методе.

Может быть эффективным встряхивание вручную мелкодисперсного твердого или полутвердого образца с подходящим растворителем; смешивание образца в присутствии растворителя в высокоскоростном гомогенизаторе или с помощью ультразвуковой обработки (США) часто обеспечивает разрушение образца и лучшую экстракцию аналита. Эта жидкофазная экстракция (LPE) или экстракция жидкость-твердое вещество (LSE) является наиболее популярной для извлечения загрязняющих веществ из образцов пищевых продуктов, таких как мясо, рыба, яйца, фрукты и овощи. Выбор растворителя – одно из наиболее важных решений, которое необходимо принять при использовании метода множественного остатка.В настоящее время существуют различные хорошо известные и эффективные общие процедуры экстракции на основе ацетонитрила, этилацетата или ацетона. ^16,30,31 Однако существует множество жидких растворителей, которые легко доступны для обеспечения среды для легкой гомогенизации в устройстве для смешивания или встряхивания. В таблице 3 сравниваются в порядке уменьшения полярности важные соображения при выборе обычных жидкостей для использования в методах определения остатков пестицидов. Методики экстракции, эффективные для извлечения как полярных, так и неполярных соединений, обычно просты и рентабельны, позволяя производить примерно 30–50 экстракций в день в лаборатории среднего размера.Основные преимущества – простота и эффективность в зависимости от используемого растворителя. Среди основных недостатков – большой объем (токсичных) растворителей и отсутствие автоматизации. ¹⁶

Таблица 3. Свойства обычных растворителей, используемых в анализе остатков пестицидов при 20–25 ° C

Способность растворителя удалять воду из исходного экстракта имеет решающее значение для обеспечения более высокой степени селективности в образцах с высоким содержанием влаги, таких как пищевые продукты. Совместная экстракция белков, сахаров и других полярных соединений имеет тенденцию увеличиваться вместе с количеством воды в экстракте, поэтому растворители, избегающие воды, обеспечивают большую селективность. Для этой цели лучше использовать этилацетат и ацетонитрил, чем ацетон, потому что воду легче удалить высаливанием.В случае ацетона необходимы неполярные сорастворители, что приводит к разбавлению экстракта и большей соэкстракции липидов. Этилацетат также легко экстрагирует липиды, что делает ацетонитрил наиболее предпочтительным растворителем в мультиклассовых методах определения остатков пестицидов при анализе пищевых продуктов. В ситуациях, связанных с кислотными / основными аналитами, pH часто является наиболее важным свойством при экстракции, и часто требуются забуференные водные растворители.

Среди процедур такого типа следует подробно упомянуть быстрый, простой, дешевый, эффективный, надежный и безопасный метод (QuEChERS).Это простая двухэтапная процедура, основанная на разделении ацетонитрилом с последующей дисперсионной очисткой SPE (dSPE) первичным вторичным амином (PSA) и / или другими сорбентами, в результате чего получается чистый экстракт, готовый для различных ГХ или высокоэффективной жидкости. аналитические методы хроматографии (ВЭЖХ). Данные о валидации и квалификации метода QuEChERS доступны для широкого спектра пестицидов в нескольких распространенных пищевых матрицах на http://www.quechers.com/default.htm. Этот подход был проверен и изменен в нескольких министерствах сельского хозяйства США, Управлении по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (AOAC Official 2007.01) и европейских (европейский метод EN 15662), и в настоящее время этот метод широко применяется для многих типов образцов остатков пестицидов. Обзоры QuEChERS начинают появляться в литературе ^32,33 , и оригинальный метод превратился в гибкий шаблон для модификации в нескольких приложениях. Имеющиеся в продаже продукты QuEChERS для экстракции и дТФЭ различных стандартных размеров и форматов делают этот подход еще проще. Кроме того, QuEChERS – это универсальный метод экстракции, который предлагает различные версии в соответствии с конкретными требованиями анализа.В 2011 году: метод доминировал в опубликованной литературе по этому вопросу для таких приложений, как определение пестицидов в фруктах и ​​овощах, ^34–36 чеснок, лук, зеленый лук и перец чили, ³⁶ сок сахарного тростника, ³⁷ и рафинированный сахар, ³⁸ рис, ³⁹ полированный рис, ⁴⁰ зерна пшеницы, мука и отруби, ⁴¹ пшеница, огурец и красное вино, ⁴² чай, ⁴³ идентификация и количественная оценка 41 остаток пестицидов в приготовленных пищевых продуктах, включая вареный картофель, редис и рис, ⁴⁴ и мед. ⁴⁵

Среди различных матриц, которые могут быть проанализированы на остатки пестицидов, особое внимание было уделено жирным матрицам. ¹² Большинство пестицидов, неполярных и гидрофобных, проявляют большое сродство к жирным компонентам матрицы, что затрудняет выделение пестицидов из жиров. Для жирных матриц широко предлагаются две методологии, основанные на: (1) QuEChERS, включая очистку с помощью дТФЭ с использованием графитированной углеродной сажи, первично-вторичного амина и сорбентов C18; (2) разделение жидкости ацетонитрилом, насыщенным петролейным эфиром, с последующим MSPD с использованием аминопропила в качестве сорбирующего материала и картриджа Флорисила для окончательной очистки на стадии элюирования. ^46,47 Кроме того, LLP в сочетании с низкотемпературным осаждением жира представляет собой простую комбинацию, которая была предложена для анализа остатков пестицидов в матрицах жирных овощей, включая определение пиретроидных инсектицидов в молоке ⁴⁸ и различных типов пестицидов в соевом масле арахисовое масло и кунжутное масло. ⁴⁹ Хотя подход кажется многообещающим, также требуется дополнительная очистка на основе dSPE с PSA и C18 в качестве сорбентов и сульфатом магния для удаления остаточной воды и / или стадия SPE с карбографом (GCB). ⁴⁹

Быстрая (30 секунд) очистка нуклеиновых кислот без использования оборудования с помощью простых в изготовлении индикаторных полосок

Разработка протокола

Болезни человека, животных и растений во всем мире наносят большой урон обществу. здоровья человека, потери производства продуктов питания и значительные финансовые затраты ^1,2,3 . Текущая пандемия COVID-19 ⁴ подчеркивает, как большой объем международных поездок и торговли в современном обществе может привести к быстрому распространению болезней по всему миру.Точная и чувствительная диагностика, которая помогает идентифицировать местонахождение болезни и определять эффективность мер контроля, имеет решающее значение для управления болезнью. Таким образом, разработка диагностических инструментов и технологий, которые могут сделать тестирование на заболевания более дешевым, простым и доступным, поможет поддержать управление болезнями и снизить ущерб, наносимый болезнями обществу.

В 2017 году мы сообщили о новом диагностическом инструменте, который позволяет очищать как ДНК, так и РНК от людей, животных, растений, микробов или вирусов в течение 30 секунд без пипетирования или электронного оборудования ⁵ .Мы воспользовались преимуществом кинетики связывания нуклеиновых кислот и высвобождения целлюлозных матриц для создания индикаторной полоски, которая может быстро связывать нуклеиновые кислоты из сложных биологических образцов (например, неочищенных экстрактов), удерживать их во время простой стадии промывки и высвобождать их непосредственно в ДНК. реакция амплификации. Щупы состоят из небольшой (8–16 мм ² ) поверхности связывания нуклеиновых кислот и пропитанной воском водоотталкивающей ручки длиной 40–50 мм для облегчения процедуры (рис. 1). Формат индикаторной полоски позволяет осуществлять захват, очистку и высвобождение нуклеиновой кислоты менее чем за 30 секунд путем последовательного погружения индикаторной полоски в образцы, промывочные растворы и растворы для амплификации ДНК.Этот метод работает для всех типов проб и организмов, которые мы пробовали, и мы продемонстрировали, что он работает в сочетании с ПЦР, количественной ПЦР в реальном времени (qPCR) и методами изотермической амплификации ДНК, опосредованной петлей амплификацией ДНК (LAMP) и рекомбиназной полимеразой. усиление (RPA) ⁵ . Элюирование нуклеиновой кислоты с тест-полоски не требует специального буфера для элюирования и было успешно достигнуто с использованием только воды, хотя прямое элюирование в смеси для амплификации ДНК обеспечивает большее извлечение нуклеиновых кислот и, следовательно, улучшенную диагностическую чувствительность.

Щуп состоит из двух частей: (1) ручки длиной 40-50 мм, пропитанной воском, и (2) зоны связывания нуклеиновой кислоты размером 2 × 6 мм.

Сильной стороной метода очистки с помощью щупа является его адаптируемость к широкому спектру применений, о чем свидетельствует его успешное использование с большим количеством организмов и несколькими буферными системами (Таблица 1). Эти данные показывают, что метод очистки с помощью щупа – надежная технология, работа которой не зависит от узкого набора условий.Для щупов требуется <10 мкл экстракта образца, что является существенным преимуществом, когда образец ткани ограничен или когда необходимо сконцентрировать следовые уровни целевых организмов ⁶ . Однако при приготовлении экстрактов большего размера один и тот же экстракт можно использовать для очистки нескольких нуклеиновых кислот. Риск перекрестного загрязнения между образцами при использовании метода очистки с помощью щупа существенно снижается, поскольку каждый образец обрабатывается последовательно, в отличие от традиционных методов, при которых образцы обычно обрабатываются одновременно.Кроме того, скорость процесса очистки требует, чтобы аликвоты всех реагентов были подготовлены заранее, а затем немедленно выброшены после использования, что еще больше снижает риск перекрестного загрязнения.

Хотя ряд субстратов может захватывать нуклеиновые кислоты ^7,8,9,10 , новинка нашего открытия заключается в преобразовании недорогой целлюлозной фильтровальной бумаги в удобный индикаторный стержень, который может быстро очищать нуклеиновые кислоты из неочищенных образцов и элюировать их непосредственно в смесь для амплификации без пипетирования.В методе с помощью щупа используется механизм очистки, отличный от механизмов других систем; считается, что он использует различия между нуклеиновыми кислотами и другими соединениями в отношении их кинетики захвата и удерживания целлюлозной матрицей ⁵ . Большие молекулы нуклеиновой кислоты быстро захватываются целлюлозой и удерживаются во время стадии промывки, тогда как другие, более мелкие соединения, включая некоторые ингибиторы амплификации ДНК, либо не связываются с целлюлозой, либо быстро высвобождаются в промывной раствор.Комбинация химических веществ в реакции амплификации, а также движение жидкости через целлюлозную матрицу (вызванное изгибанием и сжатием индикаторной полоски в небольшом реакционном объеме) приводят к высвобождению нуклеиновой кислоты. Использование немодифицированной целлюлозы имеет существенные преимущества по сравнению с использованием других субстратов, поскольку позволяет проводить связывание и промывку нуклеиновой кислоты без денатурирующих химических веществ, таких как высокие концентрации солей, которые в противном случае могут ингибировать реакцию амплификации ДНК.Неденатурирующие условия также исключают необходимость в традиционной промывке 70% этанолом и дополнительное время, необходимое для полного удаления остаточного этанола перед элюированием, что в противном случае ингибировало бы амплификацию ДНК.

Метод очистки с помощью щупа радикально отличается от традиционных методологий, потому что он разработан для простоты и скорости над урожайностью; таким образом, общие параметры, используемые для сравнения систем очистки нуклеиновых кислот, такие как эффективность выделения ДНК / РНК или общие выходы, не подходят.Более подходящими показателями эффективности являются время, стоимость и ресурсы, необходимые для очистки нуклеиновых кислот, а также целевая чувствительность, которую это придает реакции амплификации ДНК. Кроме того, невозможно рассчитать единое значение для эффективности экстракции нуклеиновой кислоты с помощью индикаторных полосок, поскольку оно зависит от объема, поглощенного индикаторными полосками, количества нуклеиновой кислоты, доступного для захвата, состава экстракта и его влияния на взаимодействие нуклеиновой кислоты с целлюлозой.В предыдущем исследовании мы оценили, что технология способна очищать ≥51% нуклеиновых кислот из образцов ⁵ , хотя ее способность очищать следовые количества матрицы (12 геномных копий) из экстракта ¹¹ является лучшим показателем. возможностей щупа.

Быстрая (30 секунд) обработка образцов методом очистки с помощью индикаторной полоски позволяет пользователям быстро обрабатывать большое количество образцов с минимальными усилиями, что делает его идеальным для высокопроизводительной очистки нуклеиновых кислот, включая молекулярную диагностику для обнаружения заболеваний, скрининг генотипа тестирование на гетерозиготность ^12,13,14 .Кроме того, доступность сырья, то есть фильтровальной бумаги на основе целлюлозы и воска, и низкая стоимость каждого щупа (<0,02 доллара США) делают выполнение молекулярных диагностических анализов с помощью этой технологии доступным в условиях ограниченных ресурсов, включая классы университетов и старших классов, полевые условия, городские условия (например, аэропорты) и развивающиеся страны.

Применение метода

Мы успешно использовали эту технологию для быстрой очистки геномной ДНК из широкого диапазона источников образцов, включая образцы крови человека и клеточные линии меланомы, а также из важных сельскохозяйственных культур, таких как пшеница, сахарный тростник. , томат, сорго, сорго, соя, рис и цитрусовые ⁵ .Мы также продемонстрировали его способность очищать выявляемые уровни грибковых ( Fusarium oxysporum ), бактериальных ( Pseudomonas syringae ) и вирусных патогенов на основе РНК (вирус мозаики огурца) из инфицированных растений, а также бактериальных патогенов ( Actinobacillus pleuropneumoniae. ) из мазков из легких свиней и патогенов человека Campylobacter jejuni и Campylobacter coli на готовом к продаже обработанном курином мясе ^5,6,11 . Способность метода обнаруживать организмы из различных таксономических доменов и царств, а также РНК-вирус, предполагает, что индикаторные полоски способны очищать нуклеиновые кислоты из любого организма при условии, что может быть создана соответствующая буферная система.

С момента публикации, быстрая очистка нуклеиновых кислот с помощью целлюлозных фильтров теперь включена в широкий спектр анализов. Был составлен актуальный список всех заявленных применений нашего метода быстрой очистки нуклеиновых кислот, включая используемый организм-мишень и буферные системы (Таблица 1). Метод очистки с помощью щупа дает преимущества для ряда распространенных исследовательских приложений. Во-первых, тест-полоски идеально подходят для рутинных лабораторных диагностических исследований, таких как высокопроизводительное генотипирование, при котором необходимо проверить большое количество биологических образцов на наличие определенных генетических маркеров.Этот метод можно считать высокопроизводительным, поскольку индикаторные полоски позволяют обработать достаточно образцов для заполнения стандартной 96-луночной ПЦР-машины в течение ~ 1 часа. В соответствии с этим, индикаторные полоски использовались для биологического штрих-кодирования раков ¹³ . Во-вторых, способность индикаторной полоски быстро обрабатывать образец от необработанной ткани до элюирования нуклеиновых кислот в реакции амплификации ДНК – без пипетирования или оборудования – идеально подходит для приложений в точке необходимости (PON). Диагностика PON выполняется на месте (например,g., ферма, поле, удаленные места), чтобы избежать задержек и логистики, связанных с транспортировкой образцов обратно в центральные лаборатории для тестирования и, таким образом, получить большую выгоду от минималистских подходов. Таким образом, ряд исследовательских групп приняли метод очистки индикаторной полоски для диагностических приложений PON, включая быструю диагностику важных болезней сельскохозяйственных культур ( Phytophthora capsica ¹⁵ и Magnaporthe oryzae (рисовая пыль) ¹⁶ ) и Возможность развертывания в полевых условиях для выявления вируса синдрома белых пятен у креветок ¹⁴ .В-третьих, индикаторные полоски идеально подходят для образовательных целей в средней школе или университетских классах естественных наук, поскольку они доступны по цене, изготовлены из легко доступных материалов и не требуют обширных технических навыков для проведения очистки. Таким образом, метод полоски, вероятно, будет способствовать более широкому внедрению молекулярной биологии в образовательные программы.

В разгар текущей пандемии SARS-CoV-2 (COVID-19) потенциальное применение технологии щупов – расширение возможностей диагностического развертывания в нелабораторных средах, таких как аэропорты, удаленные испытательные центры и т. Д. практикующие клиники.Очистка нуклеиновых кислот от образцов пациентов обычно достигается с использованием дорогих коммерческих наборов, которые требуют многоэтапных процедур и специального лабораторного оборудования. Индикаторные полоски могут обеспечить быструю очистку вирусной РНК из мазков пациента и элюировать ее непосредственно в смесь для амплификации, где ее можно будет подвергнуть обратной транскрипции и амплификации. Одностадийные анализы изотермической амплификации, опосредованной петлей обратной транскрипции (RT-LAMP), уже продемонстрировали способность обнаруживать образцы пациентов, инфицированных SARS-CoV-2, за 20 минут с пределом обнаружения всего 100 копий вируса. , без перекрестной реактивности с другими коронавирусами ^17,18 .Хотя необходимо решить такие вопросы, как безопасность пользователя и валидация анализов, быстрый анализ SARS-CoV-2 с помощью тест-полоски на месте может обеспечить более быстрое выявление и изоляцию положительных пациентов, что поможет снизить распространение болезни. .

Основным недостатком технологии является то, что индикаторные полоски очищают относительно небольшие количества нуклеиновых кислот, чего недостаточно для ряда молекулярных применений, таких как расщепление ферментами рестрикции или очистка ампликонов ПЦР.Таким образом, индикаторные полоски не подходят для общих применений очистки нуклеиновых кислот, а, скорее, лучше всего подходят для приложений, основанных на амплификации, таких как молекулярная диагностика, в которых их простота, низкая стоимость и скорость обеспечивают существенные преимущества по сравнению с существующими методами.

Сравнение с другими методами

Есть четыре ключевых особенности методологии индикаторной полоски, которые отличают ее от других методов очистки ДНК: (i) она сокращает сложный процесс очистки нуклеиновой кислоты до трех простых шагов, (ii) не делает требуется какое-либо специализированное оборудование (например,g., пипетки или центрифуги), (iii) в нем используются недорогие и легкодоступные материалы, и (iv) измерительные полоски постоянного размера можно легко и быстро изготавливать оптом. Сосредоточившись на скорости и простоте, а не на производительности, мы создали систему очистки нуклеиновых кислот, которая специально предназначена для диагностических приложений и может поддерживать приложения с высокой пропускной способностью даже в средах с ограниченными ресурсами.

Коммерчески доступные методики очистки нуклеиновых кислот обычно включают захват нуклеиновых кислот в присутствии высоких концентраций хаотропных солей (например,g., парамагнитные шарики или спин-колонки) и, по сравнению с очисткой с помощью щупа, являются более дорогостоящими и требуют больше времени. Для них требуется несколько этапов дозирования, а в случае спин-колонок – использование центрифуг ^5,7,8 . Были разработаны адаптации этих технологий с использованием различных субстратов, связывающих нуклеиновые кислоты, включая диатомовую землю ⁹ , оксид алюминия ¹⁰ и фильтры Fusion-5 ¹⁹ , но, опять же, эти адаптации сложнее настроить и требуют несколько этапов дозирования, что делает их менее практичными для высокопроизводительных или удаленных полевых приложений.Карты Flinders Technology Associates (FTA) (GE Healthcare) используют целлюлозную фильтровальную бумагу, пропитанную различными химическими веществами, чтобы помочь лизировать клеточные мембраны из таких образцов, как кровь и измельченные листья растений, и защитить высвободившуюся ДНК от разложения. Однако они отличаются от тест-полосок тем, что они предназначены для средне- и долгосрочного хранения захваченной ДНК и при использовании в качестве инструмента очистки нуклеиновых кислот требуют нескольких стадий пипетирования и промывки для элюирования ДНК ²⁰ .

Ряд исследовательских групп разработали диагностические платформы «все-в-одном» со встроенными системами для извлечения ДНК из сырых экстрактов, выполнения амплификации ДНК и обнаружения присутствия ампликонов ^21,22,23 .Это привлекательная концепция, поскольку она позволяет пользователям с ограниченными научными навыками выполнять диагностические исследования. Однако эти системы состоят из большого количества компонентов, необходимых для перемещения жидкостей внутри устройства и выполнения различных процессов. По существу, сборка этих устройств требует относительно много времени и их трудно производить в больших масштабах без значительных коммерческих инвестиций. В отличие от этого, щупы можно легко изготовить в больших масштабах, и для них потребуется всего несколько компонентов (фильтровальная бумага, воск и макаронная машина).Простота процесса производства щупов, низкая стоимость и доступность необходимых материалов являются существенным преимуществом этой технологии, которая может принести пользу пользователям в современных исследовательских лабораториях, а также в учреждениях с низким уровнем ресурсов (например, в развивающихся странах, средних школах и других странах). небольшая учебная лаборатория университета). Стоимость диагностики является важным ограничивающим фактором для промышленности и правительств; поэтому такие технологии, как система очистки щупа, которая может давать точные результаты при невысокой стоимости, очень желательны.

Перед разработкой индикаторной полоски мы продемонстрировали, что очистка нуклеиновой кислоты может быть достигнута с использованием диска диаметром 3 мм из фильтровальной бумаги Whatman ⁵ . Метод с фильтрующим диском работает по тому же процессу, что и масляные щупы, но работает медленнее, потому что растворы необходимо пипетировать на бумажный диск и с него, или диск необходимо перемещать между растворами. С момента публикации этого метода некоторые исследовательские группы приняли метод бумажного диска, включив диски в наконечник пипетки, чтобы жидкости могли более эффективно пипетировать на фильтрующий диск ^12,24 или обратно в прядильную колонку ^25. .Хотя основная технология остается той же, мы обнаружили, что формат измерительного щупа менее трудоемок в производстве в больших масштабах и не требует использования пипеток, что делает метод измерительного щупа более подходящим для высокопроизводительных приложений и сред с низким уровнем ресурсов.

Успешная амплификация с использованием прямой ПЦР или прямой LAMP, при которой небольшие объемы необработанного образца добавляются к реакциям амплификации ДНК, продемонстрировала, что некоторые типы образцов не требуют обработки перед амплификацией ^26,27 .Эти методы не включают очистку нуклеиновых кислот, а, скорее, полагаются на способность ДНК-полимераз переносить низкие уровни примесей в реакциях ²⁸ . Напротив, представленный здесь метод с помощью индикаторной полоски активно удаляет ингибиторы амплификации ДНК перед элюированием, что продемонстрировано в экспериментах, в которых образцы, добавленные непосредственно в реакции амплификации ДНК, не смогли амплифицироваться, тогда как очистка с помощью индикаторных полосок из тех же образцов привела к успешной амплификации ⁵ .Хотя дополнительные этапы обработки, такие как центрифугирование или разбавление образца, могут увеличить количество источников, которые могут использоваться для прямой ПЦР / ЛАМФ, такой метод будет более сложным и требует много времени, чем подход с использованием щупа. Как отметили первоначальные изобретатели прямой ПЦР ²⁷ , без очистки прямое добавление образца в реакции амплификации может привести к ингибированию ДНК-полимеразы. Таким образом, преимущество метода с помощью индикаторной полоски перед прямым добавлением пробы состоит в том, что процесс очистки увеличивает количество нуклеиновых кислот по сравнению с загрязнителями, что приводит к большей чувствительности и надежности.

Схема эксперимента

Высвобождение нуклеиновой кислоты из образцов

Метод, описанный здесь, должен быть применим для очистки нуклеиновых кислот из любого организма, но для различных организмов и типов образцов потребуются некоторые разработки. Первым этапом метода является гомогенизация и лизис ткани в буфере для экстракции. Оптимизация буфера для экстракции может потребоваться для обеспечения высвобождения нуклеиновых кислот и нейтрализации, разбавления или удаления ингибирующих соединений либо из экстракта, либо из буферов.Хотя мы разработали методы лизиса клеток для различных организмов и типов образцов (таблица 1), не существует априорного метода, который работал бы для всех типов образцов. Хорошей отправной точкой является использование буферов для лизиса, которые уже были разработаны для аналогичных представляющих интерес тканей / организмов (таблица 1), и их адаптация для системы очистки с помощью индикаторной полоски. Было показано, что метод очистки с помощью индикаторной полоски хорошо работает со многими обычно используемыми компонентами буфера для экстракции, включая SDS, гидрохлорид гуанидина, Tween 20 и протеиназу K ^5,11,13,24 .Мы обнаружили, что буфер для экстракции, содержащий: 20 мМ Трис (pH 8), 25 мМ NaCl, 2,5 мМ EDTA, 0,05% (вес / объем) SDS и 2% (вес / объем) PVP-40, хорошо работает со многими образцами. .

При разработке метода лизиса клеток для системы очистки индикаторной полоски важно получить представление о диапазоне концентраций целевого организма относительно концентраций соединений, которые ингибируют амплификацию ДНК в исследуемых образцах. Мы обнаружили, что в большинстве случаев высвобождение нуклеиновой кислоты может быть достигнуто за одну стадию, на которой ткань мацерируют или смешивают с буфером для лизиса клеток; например, высвобождение нуклеиновой кислоты из листьев растений может быть достигнуто путем кратковременного встряхивания листьев растения в пробирке с буфером для экстракции и шарикоподшипниками, как показано в дополнительном видеоролике к оригинальной публикации индикаторных полосок ⁵ .Недавно мы обнаружили, что нуклеиновые кислоты могут быть высвобождены из листьев растений с меньшими усилиями, если поместить небольшой сегмент листа (~ 10 × 10 мм) в небольшой пластиковый пакет Ziploc с 2 мл буфера для экстракции и быстро размять ткань пальцами (MGM, данные не показаны). Пакеты Ziploc дешевы, легки и удобны в транспортировке, и их можно выбросить после использования, что предотвращает перекрестное загрязнение образцов. Традиционная методика разрушения клеток, заключающаяся в измельчении образцов ступкой и пестиком, является медленной и очень трудоемкой и не требуется для большинства применений по очистке с помощью щупов.Таким образом, в большинстве случаев индикаторные полоски позволяют пользователям очищать нуклеиновые кислоты из сырых образцов и элюировать их в реакции амплификации ДНК в течение 30 секунд, включая стадию лизиса клеток.

Для некоторых типов образцов высвобождение нуклеиновой кислоты не может быть достигнуто за один этап; к ним относятся образцы, которые содержат следовые уровни целевого организма и могут потребовать центрифугирования ¹¹ , образцы, содержащие высокие уровни ингибирующих соединений, или образцы, содержащие инфекционные агенты, которые необходимо инактивировать перед обработкой.Таким образом, очистка нуклеиновой кислоты из этих образцов займет больше 30 секунд, причем время зависит от объема необходимой обработки образца. Соединения в образце, которые могут ингибировать реакцию амплификации ДНК, можно нейтрализовать или разбавить буфером для лизиса или удалить с помощью таких методов, как ферментативная обработка (например, протеиназа K) или центрифугирование ¹¹ .

Очистка нуклеиновых кислот с помощью тест-полосок

После того, как нуклеиновые кислоты окажутся в растворе, их можно быстро очистить с помощью тест-полосок в три быстрых этапа (рис.2, дополнительное видео 1). Сначала в экстракт образца погружают полоски для определения нуклеиновых кислот (рис. 2а). Щуп типичного размера с площадью захвата 2 × 6 мм впитает примерно 2–4 мкл образца и улавливает нуклеиновые кислоты, присутствующие в этом объеме. Точный объем пробы, взятой щупом, прямо пропорционален площади его зоны связывания нуклеиновой кислоты; таким образом, размер этой зоны следует отрегулировать в соответствии с условиями применения.

a , Нуклеиновые кислоты улавливаются погружением индикаторной полоски в образец до тех пор, пока зона связывания нуклеиновой кислоты индикаторной полоски не будет насыщена раствором. b . Загрязняющие соединения удаляют 5-кратным погружением в промывочный буфер. c . Нуклеиновые кислоты элюируют 15-кратным погружением непосредственно в реакцию амплификации.

Во-вторых, индикаторные полоски погружаются в промывной раствор для удаления загрязнений из образца, которые могут ингибировать реакцию амплификации ДНК (рис.2б). Мы обнаружили, что погружение щупа пять раз в 10 мМ Трис (pH 8) идеально подходит для большинства применений. Однако для экстрактов образцов с большим количеством примесей увеличение количества погружений в промывочный буфер может помочь повысить надежность анализа. Кроме того, включение хлорида магния в промывочный буфер может предотвратить снижение концентрации ионов магния в реакции амплификации, а также может помочь нейтрализовать эффекты загрязняющих ионов (например, Ca ²⁺ ) из образца ^11,29 .

В-третьих, индикаторную полоску погружают непосредственно в реакцию амплификации для элюирования нуклеиновых кислот (рис. 2c). Мы обнаружили, что погружение индикаторных полосок в реакцию амплификации 15 раз дает нуклеиновым кислотам достаточное количество времени для высвобождения из индикаторных полосок. Для достижения наилучших результатов мы максимизируем движение жидкости через измерительный стержень, проталкивая зону связывания нуклеиновой кислоты измерительного стержня на дно пробирки с каждым погружением, чтобы стимулировать высвобождение нуклеиновой кислоты (рис. 2c). По завершении тест-полоску можно выбросить, и реакция амплификации ДНК готова к запуску.Очистка с помощью индикаторной полоски успешно использовалась в сочетании с технологиями ПЦР и изотермической (LAMP, RPA) амплификации ДНК ⁵ .

Ограничения

В отличие от широко используемых методов твердофазной нуклеиновой кислоты, таких как спин-колонки с диоксидом кремния или парамагнитные шарики, метод очистки с помощью индикаторной полоски практически не концентрирует нуклеиновые кислоты в образце. Индикаторные полоски очищают нуклеиновые кислоты из небольшого объема образца, который поглощается целлюлозными волокнами.Таким образом, целевые нуклеиновые кислоты должны иметь достаточную концентрацию в образце, чтобы можно было обнаруживать амплификацию ДНК. Однако индикаторные полоски можно использовать для амплификации следовых количеств нуклеиновых кислот; мы обнаружили всего 12 копий Campylobacter spp . генома (подтверждено стандартным подсчетом клеток на основе культур на тех же образцах) с использованием технологии полоски в сочетании с амплификацией LAMP ¹¹ . Кроме того, небольшой объем улавливающих щупов делает их непригодными для очистки больших количеств нуклеиновых кислот.Система масляного щупа предназначена для значительного увеличения скорости и упрощения процесса очистки; таким образом, если от образца требуется несколько реакций амплификации ДНК, потребуется очистка отдельных индикаторных полосок, на выполнение каждой из которых потребуется дополнительно 30 секунд.