Содержание

Ст 81 ТК РФ 2019-2020 года

Вопрос

Женщину, находящуюся в декретном отпуске, вызвали на работу для написания заявления на увольнение в связи с ликвидацией компании. При этом руководство открыло новую фирму, в приеме в которую женщине было отказано (точнее, пообещали принять после завершения декретного отпуска). Как обезопасить себя в данной ситуации? Кто обязан платить декретные?

Ответ юриста:

Согласно ст. 261 ТК РФ допускается расторжение трудового контракта с беременной сотрудницей по инициативе работодателя в случае ликвидации предприятия. При этом реорганизация компании, связанная с процессами слияния, выделения, поглощения, разделения, не признается основанием для увольнения беременных работниц.

В ходе ликвидации организации беременным работницам предоставляются же права, что и прочим сотрудникам. В частности, в силу п.2 ст. 180 ТК РФ работодатель обязан в письменном виде предупредить беременную женщину о предстоящей ликвидации не позднее, чем за 2 месяца. Увольнение в данном случае осуществляется по п.1 ч.1 ст. 81 ТК РФ.

В соответствии со ст. 140 ТК РФ в день увольнения должен быть произведен полный расчет. При этом выплаты в отношении беременной сотрудницы состоят из:

  • выходного пособия;
  • компенсации за неиспользованные отпуска;
  • невыплаченной зарплаты включительно по дату увольнения.

Кроме того, беременная работница имеет возможность обратиться к руководству компании с ходатайством об оказании ей помощи ввиду сложного материального положения, однако, данная выплата не носит обязательного характера.

После увольнения беременная сотрудница может ожидать только выплат, положенных ей в рамках соцпомощи. Что касается пособия по беременности и родам, то женщинам, уволенным в связи с ликвидацией компании, его назначение и выплату осуществляет управление соцзащиты населения.

Вопрос

Механик транспортного предприятия был срочно вызван на работу в выходной день, поскольку требовалось отремонтировать автомашину, попавшую в ДТП. На работу был вызван вечером, с утра выпивал. Во время ремонта подошел директор, почувствовал запах алкоголя. Механик был отправлен в медпункт на освидетельствование. Тест показал 0,97 промилле алкоголя. Несмотря на то, что от работы механика не отстранили, был составлен акт и от работника потребовали объяснительную записку. В настоящее время поставлен вопрос об увольнении. Как грамотно написать объяснительную записку, чтобы избежать увольнения?

Ответ юриста:

Действительно, согласно ст. 81 ТК РФ, возможным является расторжение трудового договора по инициативе работодателей в случае появления сотрудников на работе в состоянии опьянения. При этом состояние опьянения должно быть подтверждено доказательствами (медицинскими заключениями, объяснениями очевидцев, служебными записками). Срочный вызов сотрудника на работу в его выходной день должен быть оформлен документально. Если такого оформления не имеется, говорить о работе сотрудника не приходится, в сущности, его вызов на работу является незаконным. Эти факты и следует отразить в объяснительной записке, добавив, что вызов на работу был неожиданным, а в трудовом договоре отсутствует обязательство работника отказаться от приема алкоголя в целях того, чтобы всегда быть готовым к внезапному вызову. Полезным будет также указание на то, что работник вышел на работу лично только для того, чтобы довести до сведения руководства невозможность исполнения трудовых функций в выходной день без предварительного уведомления.

Вопрос

Мать годовалого ребенка находится в отпуске по уходу за ним. Компания, в которой она работала начальником секретариата, ликвидируется. Об этом все сотрудники компании были уведомлены за 2 месяца. По истечении 2-месячного срока работникам были выданы трудовые книжки с внесенной записью об увольнении, однако, в выплате выходного пособия было отказано. Что делать, как добиться справедливости?

Ответ юриста:

Согласно п. 1 ст. 81 ТК РФ возможным является расторжение трудовых договоров по инициативе работодателя, если предстоит ликвидация компании. При этом в случае ликвидации организации допускается увольнение сотрудников, в том числе, пребывающих в отпуске. В соответствии со ст. 84-1 ТК РФ в день увольнения работодатель обязан выдать сотруднику трудовую книжку и полный расчет по зарплате. В целях восстановления нарушенных прав сотрудник может в течение 3-х месяцев с момента увольнения обратиться в трудовую инспекцию, прокуратуру либо суд. В случае невыплаты зарплаты руководитель организации-работодателя может быть привлечен к ответственности по ст. 5.27 КоАП РФ, а при задолженности свыше 3-х месяцев - по ст. 145.1 УК РФ.

Вопрос

Журналисту газеты было предложено на тех же организационных и финансовых условиях работать в журнале (требуется исполнять аналогичные трудовые функции, выдавать тот же объем печатных материалов, редакция находится в том же месте, величина зарплаты такая же). Сотрудник отказался от этого предложения. В этой связи работодатель с согласия журналиста увольняет его по основаниям, предусмотренным в п.7 ч.1 ст.77 ТК РФ. Обязан ли в данном случае работодатель выплатить выходное пособие?

Ответ юриста:

В силу ст.178 ТК РФ работодатель обязан выплатить сотруднику выходное пособие, равное 2-недельному среднему заработку. Подобное пособие подлежит выплате при расторжении трудового контракта по причине отказа сотрудника от продолжения трудовой деятельности (ввиду изменений определенных ранее сторонами условий трудового контракта (п.7 ч.1 ст.77 ТК РФ)).

Вопрос

Механика, сотрудника ГЭС, имеющего 20-летний стаж, собираются неправомерно уволить за прогул. Данный работник пребывал в очередном отпуске в период с 16.01.2016 года по 05.02.2016 года. В последний день отпуска мужчина почувствовал себя плохо, посетил врача и получил больничный листок до 16.02.2016 года. 17.02.2016 года сотрудник вышел на работу, однако, не был к ней допущен ввиду того, что в этот день на работе отсутствовал психолог (в соответствии с регламентом, действующим на ГЭС, допуск обслуживающего персонала к работе осуществляется, в том числе, психологом). Начальник департамента кадров сообщил работнику, что вина за невыход на работу лежит полностью на нем, так как о прохождении психолога необходимо было озаботиться заблаговременно. Насколько правомерны претензии начальника департамента кадров и будет ли законным в данном случае увольнение за прогул?

Ответ юриста:

Согласно п. 6 «а» ст. 81 ТК РФ трудовой договор подлежит расторжению по инициативе работодателя в случае совершения сотрудником прогула, предполагающего отсутствие на месте работы без уважительной причины в течение полной смены либо свыше 4-х часов подряд в течение рабочего дня. В данной ситуации работник своевременно появился на рабочем месте, поэтому оснований для увольнения по п.п. а) п.6 ст. 81 ТК РФ не имеется. Согласно ст. 76 ТК РФ, работодатели имеют право не допускать к работе сотрудников, находящихся на работе в алкогольном, наркотическом либо токсическом опьянении, не прошедших обучение и контроль знаний, а также обязательный медосмотр. При этом озаботиться проведением медосмотра обязана администрация предприятия (если иное не предусмотрено трудовым договором либо локальным нормативным актом). Незаконное отстранение от работы по основанию отказа от прохождения осмотра является поводом для обращения с жалобой в трудовую инспекцию.

Вопрос

Бухгалтер в течение 4-х лет работает в организации на основании срочного трудового договора, который оформлялся в целях замены основного сотрудника. Имеет высшее профильное образование, нарекания за весь период работы отсутствуют. Некоторое время назад в бухгалтерии предприятия возникла вакансия, вследствие чего бухгалтером было написано заявление о переводе на нее. Однако руководитель организации согласия на данный перевод не дал и объяснений никаких не предоставил. Имеется подозрение, что этот отказ связан с беременностью бухгалтера. Законен ли отказ в переводе в данной ситуации?

Ответ юриста:

Согласно ст. 261 ТК РФ при окончании срочного трудового договора во время беременности сотрудницы работодатель должен на основании ее письменного заявления и медицинской справки продлить период действия договора вплоть до окончания беременности. Следует отметить, что увольнение сотрудницы, ввиду истечения срока договора в период беременности допустимо, если договор был оформлен на период замены отсутствующего работника и отсутствует возможность перевода на вакантную должность. При этом работодатель обязан предлагать такой сотруднице любые вакансии в данной местности, которые соответствуют квалификации женщины, работу по которым женщина сможет выполнять с учетом состояния своего здоровья.

В случае расторжения работодателем трудового контракта в нарушение ст. 261 ТК РФ, необходимо обратиться с жалобой в трудовую инспекцию, прокуратуру либо суд.

Вопрос

С 15 ноября специалист-электрик находится на больничном вследствие перелома руки. 01 декабря по телефону он был уведомлен начальником отдела кадров, что занимаемая им должность попала под сокращение. Поэтому после закрытия больничного листа электрику требуется прийти и оформить в отделе кадров все необходимые документы по сокращению. Специалиста такое положение дел не устраивает. Имеется ли выход? Нет ли в данном случае нарушения трудового законодательства?

Ответ юриста:

На основании п. 2 ч. 1 ст. 81 ТК РФ расторжение трудового договора может иметь место при сокращении численности. При этом согласно ч. 2 ст. 180 ТК РФ о грядущем увольнении работодатель обязан в персональном порядке предупредить работников под подпись не позднее, чем за 2 месяца до фактического увольнения. Продления данного срока на время нетрудоспособности специалиста нормами права не предусматривается. При этом согласно ч. 6 ст. 81 ТК РФ в период нетрудоспособности специалиста увольнение недопустимо. В данном случае течение 2-месячного срока начнется с момента выхода специалиста с больничного и получения под подпись уведомления о сокращении. При этом специалист вправе: согласиться на расторжение договора в более ранний срок, но с выплатой компенсации; требовать перевода на иную работу из числа вакансий, имеющихся в компании; обратиться в суд с исковыми требованиями о восстановлении в должности и выплате суммы, соответствующей среднему заработку, если увольнение было проведено с нарушениями.

Вопрос

20 августа 2014г. я устроилась на работу бухгалтером. Через месяца узнала, что беременна. Ушла на больничный по состоянию здоровья. Позвонил генеральный директор и сказал, что мою должность сокращают и мне надо написать заявление на увольнение по собственному желанию. Предложил должность уборщицы и соответствующую оплату. Имеют ли они на это право, понизить меня в должности и урезать мне оклад до минимума. И если все же так сделают, куда обращаться?

Ответ юриста:

Не допускается увольнение беременной работницы по инициативе работодателя, за исключением случаев ликвидации организации или прекращения деятельности индивидуального предпринимателя, у которых она трудоустроена (часть первая ст. 261 ТК РФ). Поскольку при сокращении численности (штата) работников не происходит прекращения деятельности организации или индивидуального предпринимателя, беременная сотрудница не может быть уволена по данному основанию (см. письмо Федеральной службы по труду и занятости от 02.04.2010 N 902-6-1). Работодатель обязан сохранить за ней ее должность. Незаконное увольнение беременной сотрудницы может повлечь за собой обязанность работодателя восстановить ее на работе и выплатить ей средний заработок за все время вынужденного прогула или разницу в заработке при выполнении ею нижеоплачиваемой работы (части первая и вторая ст. 394 ТК РФ). Также работница может потребовать компенсации ей морального вреда, причиненного незаконным увольнением (часть девятая ст. 394 ТК РФ). Кроме того, работодатель может быть привлечен к административной ответственности по ст. 5.27 КоАП РФ.

В случае вашего увольнения - обращаетесь в суд.

Вопрос

Сотрудница фирмы, пребывающая в декретном отпуске, сделала звонок в отдел кадров. При попытке согласовать время выхода из отпуска, она получила информацию, что ее должность сокращена, и в самое ближайшее время ей надлежит явиться для увольнения. Законны ли действия работодателя?

Ответ юриста:

В соответствии со ст. 256 ТК РФ, на весь период отпуска, связанного с уходом за ребенком, за сотрудником должно быть сохранено рабочее место. Кроме того, согласно ст. 261 ТК РФ недопустимым является расторжение трудовых договоров по инициативе работодателей с матерями, имеющими детей в возрасте до 3-х лет. Таким образом, в данном случае действия работодателя не основаны на законе. Сотрудница может смело выходить из отпуска, предварительно письменно уведомив работодателя о дате выхода. В случае нарушения работодателем вышеупомянутых статей ТК РФ женщине необходимо обратиться с заявлением в трудовую инспекцию, прокуратуру либо суд.

Вопрос

Руководитель грубо унизил работницу и принудил ее к написанию заявления об увольнении по собственному желанию. В действительности, увольняться сотрудница не стремится. Может ли работница быть уволена, если она не находится в декретном отпуске, а возраст ребенка еще не достиг 3-х лет?

Ответ юриста:

Расторжение трудовых контрактов с женщинами, имеющими детей до 3-летнего возраста, согласно ч. 4 ст. 261 ТК РФ, по инициативе работодателя недопустимо. Исключением следует признать увольнение в соответствии с п. 1, 5 — 8, 10, 11 ст. 81 ТК РФ либо п. 2 ст. 336 ТК РФ. Если имеются доказательства того, что сотрудницу принудили к написанию заявления об увольнении по собственному желанию, эффективной формой защиты будет обращение в прокуратуру либо ГИТ.

Условия законности увольнения за неоднократные нарушения

Эксперты отметили, что определение ВС РФ соответствует сложившейся судебной практике, а также указали на частую ошибку работодателей, которые рассматривают неоднократность и повторность не к моменту совершения «финального» проступка, а к моменту увольнения, что влечет за собой признание его незаконным.

Бывший работник обратился к работодателю с иском о восстановлении на работе, взыскании среднего заработка за время вынужденного прогула и компенсации морального вреда.

Как указал истец, по результатам служебной проверки он был дважды в один день привлечен к дисциплинарной ответственности в виде замечания и увольнения. Трудовой договор с ним был расторгнут, и он был уволен по п. 5 ч. 1 ст. 81 Трудового кодекса РФ, то есть за неоднократное неисполнение работником без уважительных причин трудовых обязанностей, если он имеет дисциплинарное взыскание.

В обоснование своих требований истец указал, что возложенные на него обязанности он выполнял надлежащим образом, дисциплинарных взысканий до этого момента не имел. Также он указал, что у работодателя не имелось оснований для наложения на него дисциплинарного взыскания, при его наложении не были учтены тяжесть совершенного проступка и предшествующее поведение работника. Кроме того, по мнению истца, увольнение по п. 5 ч. 1 ст. 81 ТК РФ возможно только в том случае, если неисполнение работником без уважительных причин трудовых обязанностей является повторным, то есть имеющим место после того, как к нему было применено дисциплинарное взыскание. Дисциплинарные взыскания в виде замечания и увольнения были применены к нему в один день, что свидетельствует об отсутствии признака повторности в его действиях.

Решением суда первой инстанции, оставленным без изменения судом апелляционной инстанции, в удовлетворении исковых требований было отказано. Суды исходили из того, что на момент привлечения истца  к дисциплинарной ответственности в виде увольнения он имел дисциплинарное взыскание в виде замечания, которое не было снято и не погашено. Кроме того, суд пришел к выводу о пропуске срока обращения в суд, предусмотренного ст. 392 ТК РФ, поскольку истец обратился в суд более чем месяц спустя после подписания приказа об увольнении, с которым отказался ознакомиться.

Изучив материалы дела, Судебная коллегия по гражданским делам ВС РФ сочла поданную истцом жалобу на эти решения подлежащей удовлетворению.

Верховный Суд напомнил, что в соответствии с п. 33 Постановления Пленума ВС РФ от 17 марта 2004 г. № 2 при разрешении споров об увольнениях по п. 5 ч. 1 ст. 81 ТК РФ за неоднократное неисполнение без уважительных причин трудовых обязанностей судам следует учитывать, что работодатель вправе расторгнуть трудовой договор по данному основанию при условии, что к работнику ранее было применено дисциплинарное взыскание и на момент повторного неисполнения им без уважительных причин трудовых обязанностей оно не снято и не погашено. При этом применение к работнику нового дисциплинарного взыскания, в том числе и увольнения, допустимо также, если неисполнение или ненадлежащее исполнение по вине работника возложенных на него трудовых обязанностей продолжалось, несмотря на наложение дисциплинарного взыскания.

Верховный Суд указал, что выводы нижестоящих судов о неоднократном неисполнении истцом трудовых обязанностей без уважительных причин и наличии в связи с этим у ответчика оснований для его увольнения по п. 5 ч. 1 ст. 81 ТК РФ неправомерны. Из материалов дела следует, что ни до, ни после вынесения приказа о привлечении истца к дисциплинарной ответственности в виде замечания какого-либо неисполнения без уважительных причин трудовых обязанностей последним допущено не было. Таким образом, отметил ВС РФ, выводы нижестоящих судов о неоднократном неисполнении С. без уважительных причин трудовых обязанностей и наличии в связи с этим у ответчика оснований для его увольнения по п. 5 ч. 1 ст. 81 ТК РФ неправомерны.

Кроме того, Суд признал нарушающими закон выводы судов о пропуске срока обращения в суд, поскольку он обратился с исковым заявлением лишь после ознакомления с приказом об увольнении, соблюдя установленный законом срок.

Таким образом, Верховный Суд определил отменить решения судов нижестоящих инстанций и направить дело на новое рассмотрение.

Адвокат, партнер АБ «Андрей Городисский и Партнеры» Кристина Тимошенко отметила, что данное определение ВС РФ соответствует сложившейся к настоящему времени судебной практике и трактовке судами понятия неоднократности при увольнении по инициативе работодателя по п. 5 ч. 1 ст. 81 ТК РФ. По ее словам, подход судов состоит из двух обязательных элементов – неоднократность неисполнения и последовательность применения дисциплинарных взысканий. Они заключаются в том, что к моменту совершения дисциплинарного проступка, который в итоге явился основанием для увольнения, работник должен уже иметь дисциплинарное взыскание за нарушение, которое было допущено им ранее.

Таким образом, пояснила адвокат, применение к работнику дисциплинарного взыскания в виде увольнения по п. 5 ч. 1 ст. 81 ТК РФ допускается лишь после того, как он был предупрежден работодателем о недопустимости неисполнения должностных обязанностей путем наложения замечания или выговора, но, несмотря на это, совершил дисциплинарный проступок снова.

Кристина Тимошенко также отметила, что довольно часто работодатели допускают ошибки при увольнении по данному основанию, рассматривая неоднократность и повторность не к моменту совершения «финального» проступка, а к моменту увольнения, что влечет за собой признание его незаконным.

Ведущий юрист юридической компании «Митрофанова и Партнеры» Полина Журенкова высказала аналогичное мнение. Она также обратила внимание на то, что законом предусмотрено право работодателя уволить работника, неоднократно нарушившего трудовую дисциплину, но при этом не уточнено, должно ли между двумя случаями привлечения к ответственности пройти какое-то время или работодатель вправе, обнаружив два правонарушения работника в один день, привлечь его к ответственности за их совершение и сразу уволить. Это, по словам эксперта, приводит к возникновению спорных ситуаций, одна из которых стала предметом рассмотрения в определении ВС РФ.

«Если работодатель выявил несколько нарушений, к примеру, за прошлый месяц, неправомерно применять ответственность за каждое из них в отдельности и увольнять работника в один день. Именно на это и указал Верховный Суд. Это не следует из прямого толкования норм законодательства, но соответствует логике и целям привлечения к дисциплинарной ответственности», – подчеркнула Полина Журенкова.

По мнению адвоката АП Нижегородской области Василия Шавина, решение ВС РФ иллюстрирует сущностные проблемы судебной системы. «Верховный Суд занимается не своим делом, поскольку физически не может проверить все 14 миллионов гражданских дел. По данному делу руководителям судебной системы можно было задуматься: почему приняты такие решения нижестоящими судами? Все ли у судей хорошо с квалификацией или мотивацией? И принимать решения не только по конкретному делу, но и по конкретным судьям», – считает Василий Шавин.

Увольнение работника по П. 5 СТ. 81 ТК РФ

В Трудовом кодексе предусмотрено увольнение работника в связи с неоднократным неисполнением им без уважительных причин трудовых обязанностей. Это основание прекращения трудового договора не является новым, оно носит преемственный характер. Ранее это основание находило закрепление в п. "г" ст. 47 КЗоТ 1922 г., в п. 3 ч. 1 ст. 33 КЗоТ 1971 г., а ныне - в п. 5 ч. 1 ст. 81 ТК РФ и относится к основаниям прекращения трудового договора по инициативе работодателя.

Это основание расторжения трудового договора применяется на практике нередко. Но, несмотря на достаточно подробную регламентацию порядка увольнения по данному основанию, применение его вызывает некоторые сложности.
Представляется, что при характеристике увольнения по п. 5 ч. 1 ст. 81 ТК РФ необходимо отметить основные положения, имеющие значение в правоприменительной практике. Эти положения важны как для понимания сущности основания прекращения трудового договора по рассматриваемому основанию, так и для соблюдения процедуры увольнения.

Основные положения

Первое положение относится к формулировке: "неисполнение работником без уважительных причин трудовых обязанностей...". Неисполнение или ненадлежащее исполнение по вине работника возложенных на него трудовых обязанностей трактуется в соответствии со ст. 192 ТК РФ как дисциплинарный проступок. Поэтому рассматриваемое основание прекращения трудового договора в теории трудового права относится к категории дисциплинарных. Это положение находит закрепление в Кодексе: в ч. 3 ст. 192 ТК РФ указаны основания прекращения трудового договора, относящиеся к дисциплинарным взысканиям (п. п. 5, 6, 9 или 10 ч. 1 ст. 81; п. 1 ст. 336 или ст. 348.11 ТК РФ; п. п. 7 и 8 ч. 1 ст. 81 ТК РФ). В последнем случае законодатель обращает внимание на то, что увольнение по п. п. 7 и 8 ч. 1 ст. 81 ТК РФ относится к дисциплинарным, если дисциплинарный проступок совершен по месту работы.

К дисциплинарным проступкам, в частности, относятся: нарушение требований законодательства, обязательств по трудовому договору, нарушение правил внутреннего трудового распорядка, должностных инструкций, положений, приказов работодателя, технических правил и т.п. (п. 35 Постановления Пленума Верховного Суда Российской Федерации от 17.03.2004 N 2 "О применении судами Российской Федерации Трудового кодекса Российской Федерации") .
--------------------------------
Бюллетень Верховного Суда РФ. 2004. N 6.

В этом отношении необходимо отметить, что многие руководящие разъяснения вышеназванного Постановления Пленума Верховного Суда РФ носят преемственный характер .
--------------------------------
Так, основные положения Постановления Пленума Верховного Суда РФ от 17.03.2004 N 2 "О применении судами Российской Федерации Трудового кодекса Российской Федерации" в новой редакции его от 28.12.2006 были заимствованы из текста Постановления Пленума Верховного Суда РФ от 22 декабря 1992 г. N 16 "О некоторых вопросах применения судами Российской Федерации законодательства при разрешении трудовых споров", с последующими изменениями и дополнениями // Бюллетень Верховного Суда РФ. 1993. N 3.

Отнесение основания прекращения трудового договора к категории дисциплинарных означает, что при увольнении по данному основанию обязательно должны быть учтены (соблюдены) как правила наложения дисциплинарного взыскания, так и правила увольнения. Поскольку речь идет об увольнении за неисполнение работником трудовых обязанностей, то очень важно определить, какие проступки могут быть отнесены к таковым. Необходимо отметить, что практикой выработан примерный перечень проступков такого рода.

К таким нарушениям в соответствии с п. 35 Постановления Пленума Верховного Суда РФ от 17.03.2004 N 2 "О применении судами Российской Федерации Трудового кодекса Российской Федерации" относятся:
а) отсутствие работника без уважительных причин на работе либо рабочем месте;
б) отказ работника без уважительных причин от выполнения трудовых обязанностей в связи с изменением в установленном порядке норм труда (ст. 162 ТК РФ), так как в силу трудового договора работник обязан выполнять обусловленную этим договором трудовую функцию, соблюдать действующие в организации правила внутреннего трудового распорядка;
в) отказ или уклонение без уважительных причин от медицинского освидетельствования работников некоторых профессий, а также отказ работника от прохождения в рабочее время специального обучения и сдачи экзаменов по охране труда, технике безопасности и правилам эксплуатации, если это является обязательным условием допуска к работе.

Нельзя не сказать еще об одном существующем преемственном положении, которое, как и ранее, представлено в п. 37 Постановления Пленума Верховного Суда РФ от 17.03.2004 N 2 (в ред. от 28.12.2006) . Таким рассматривается вариант поведения, который нельзя рассматривать как нарушение трудовой дисциплины: отказ работника от выполнения распоряжения работодателя о выходе на работу до окончания отпуска, если речь идет о досрочном отзыве работника из отпуска по инициативе администрации, в связи с тем, что законом не предусмотрено право администрации такого рода без согласия работника.
--------------------------------
Бюллетень Верховного Суда РФ. 2007. N 3.

Исходя из того, что увольнение по п. 5 ч. 1 ст. 81 ТК РФ относится к дисциплинарным, необходимо обратить внимание на обязательность установления факта совершения дисциплинарного проступка. Факт совершения проступка в действительности должен иметь место. Обязанность предоставить доказательства возлагаются на работодателя (пп. 1 п. 34 Постановления Пленума Верховного Суда РФ от 17.03.2004 N 2 (в ред. от 28.12.2006)). Поэтому работодатель должен затребовать от работника письменное объяснение (ч. 1 ст. 193 ТК РФ). Косвенно законодателем установлены сроки истребования такового - два рабочих дня. Так, если по истечении двух рабочих дней объяснение работником не представлено, то составляется соответствующий акт. Следовательно, факт совершения дисциплинарного проступка устанавливается либо объяснением работника, либо актом. В том случае, если отсутствует объяснение работника, обязательно должен быть акт. Поэтому законодатель предусматривает следующее положение: для применения дисциплинарного взыскания не является препятствием отсутствие объяснения работника (ч. 2 ст. 193 ТК РФ).

Судебная практика

В правоприменительной практике при увольнении по рассматриваемому основанию возникают ситуации, когда необходимо решить вопрос о том, на самом ли деле работник не исполнил обязанности и входят ли данные действия в круг его должностных обязанностей.

Пример. Так, суд, рассматривая дело об увольнении К., уволенного по п. 3 ч. 1 ст. 33 КЗоТ РФ 9 февраля 1999 г., пришел к выводу о том, что производство автотовароведческих экспертиз входит в должностные обязанности эксперта отдела криминалистических исследований. Истец утверждал обратное, так как не был согласен с формулировкой увольнения. Как следует из материалов гражданского дела, К. был принят на работу в Сахалинскую научно-исследовательскую лабораторию судебной экспертизы младшим научным сотрудником. В соответствии с приказом от 21.02.1992 N 7 он был переведен в отдел КИ младшим научным сотрудником со специализацией по трасологическим и баллистическим экспертизам и производству автотовароведческих экспертиз. В 1991 и 1993 г. К. обучался в Ленинградской, Саратовской НИЛСЭ по специальности автотовароведческая экспертиза, имеет свидетельство от 28.10.1993 N 159, подтверждающее его право на проведение данных исследований. С 1 января 1995 г. в связи с переименованием Сахалинской НИЛСЭ в Сахалинскую лабораторию судебной экспертизы были переименованы и должности сотрудников. Истец согласно приказу от 29.12.1994 N 35, назначен экспертом, при этом, как пояснил ответчик, ему по-прежнему вменялось в обязанности производство баллистических, трасологических и автотовароведческих экспертиз. Истец пояснил, что действительно выполнял все виды указанных исследований, причем большую часть рабочего времени занимался баллистическими и трасологическими исследованиями, а производство товароведческих экспертиз выполнялось им на договорной основе.

Согласно Перечню родов экспертиз, методов экспертного исследования, экспертных специальностей, утвержденному 11 ноября 1996 г. заместителем министра юстиции, товароведческая экспертиза является одним из видов исследований, проводимых лабораторией судебной экспертизы, и включает в себя исследование транспортных средств в целях определения их стоимости. В приказе о приеме на работу, в последующем приказе 21 февраля 1992 г. четко определены и сформулированы обязанности истца по проведению трасологических, баллистических исследований и автотовароведческих экспертиз. В приказе о назначении истца на должность эксперта с 1 января 1995 г. не указано, по какой специальности он обязан производить исследования. Однако, как следует из должностных обязанностей эксперта, который исполняет их в силу имеющихся у него специальных познаний, в судебном заседании установлено и следует из материалов дела, истец имеет специальные познания в области товароведения, кроме того, он аттестован по данной специальности, он подтвердил в судебном заседании, что именно данные виды исследования вменены ему в должностные обязанности согласно приказам лаборатории, поэтому он несет ответственность за неисполнение или ненадлежащее исполнение возможных обязанностей по проведению вышеназванных криминалистических исследований, в том числе и автотовароведческих.

Таким образом, суд признал доводы истца о том, что производство автотовароведческих экспертиз не входило в круг его должностных обязанностей, несостоятельными. И признал увольнение К. правомерным, принимая во внимание и другие обстоятельства дела .
--------------------------------
Гражданское дело из архива Южно-Сахалинского городского суда. N 2-1289/2000.

Безусловно, при применении п. 5 ч. 1 ст. 81 ТК РФ работодатель должен учитывать только те взыскания, наложенные за совершенные проступки, которые не оспорены работником. В случае если взыскание не признано (правомерно возложенным) законным в судебном порядке, оно не имеет правового значения.

По другому делу работница оспорила наложение дисциплинарного взыскания, но суд признал наложение дисциплинарного взыскания правомерным. И в этом случае судом рассматривался вопрос о том, входят (или нет) в круг должностных обязанностей определенные действия работника.

Пример. Так, Г.М. Медяник с 30 мая 2003 г. работала в МУЗ "КЦРБ" врачом-травматологом. Приказом главного врача от 18 октября 2005 N 451 ей объявлен выговор за отказ в приеме больного. Не согласившись с взысканием, 3 ноября 2005 г. Г.М. Медяник обратилась с иском, в котором просила отменить приказ от 18 октября 2005 N 451 В обоснование своих требований она указала, что 4 октября 2005 г. больной К. при обращении за медицинской помощью предъявил недействительный страховой полис.

По правилам обязательного медицинского страхования (ОМС) при обращении за медицинской помощью застрахованный обязан предъявить полис вместе с документом, удостоверяющим личность. Учитывая, что у пациента К., по сути дела, не было страхового полиса, ему было предложено оказание платных медицинских услуг в системе добровольного медицинского страхования (ДМС), от которого он категорически отказался. Больной К. в экстренной медицинской помощи на момент обращения не нуждался, травму получил свыше месяца назад (лечение травмы осуществлялось ранее).

В результате суд признал, что истица не исполнила свои прямые должностные обязанности, отказавшись принять больного и оказать ему необходимую медицинскую помощь. Своим бездействием она нарушила один из основных принципов здравоохранения - принцип гуманного отношения к больному, который обратился к врачу за облегчением физической боли. Руководство МУЗ "КЦРБ" пришло к правильному выводу о неисполнении Г.М. Медяник своих должностных обязанностей и обоснованно привлекло ее к дисциплинарной ответственности. Следовательно, при повторном совершении дисциплинарного проступка эта работница может быть уволена по п. 5 ч. 1 ст. 81 ТК РФ.

Второе положение относится к определению "неоднократное". Под термином "неоднократное" необходимо понимать совершение действия повторно. Это означает, что работник продолжает неисполнение трудовых обязанностей, несмотря на применение к нему дисциплинарного взыскания.
Как было отмечено, в ранее действовавших КЗоТах (1922, 1971 гг.) содержалось аналогичное основание увольнения. Правда, с 1922 г. термин при формулировке данного основания увольнения законодатель использовал иной - "систематическое", что вызывало определенную сложность на практике. Правда, и в то время Пленум Верховного Суда СССР разъяснял, что при конкретных обстоятельствах с учетом характера совершенного работником дисциплинарного проступка и ранее примененной меры взыскания систематическим может быть признано и повторное неисполнение работником без уважительных причин трудовых обязанностей (см.: п. 10 Постановления Пленума Верховного Суда СССР от 19 октября 1971 г.) . Позже в Постановлении Пленума было приведено толкование термина "систематическое неисполнение трудовых обязанностей" следующим образом: "если неисполнение или ненадлежащее исполнение по вине работника продолжалось, несмотря на наложение дисциплинарного... взыскания, допустимо применение к нему нового дисциплинарного... взыскания, в том числе и увольнения по п. 3 ч. 1 ст. 33 КЗоТ РФ (п. 32 Постановления Пленума Верховного Суда РФ от 22.12.1992 N 16)". То есть в этом толковании уже прослеживается общий смысл увольнения при неоднократности совершения дисциплинарного проступка. Таким образом, именно на практике постепенно вырабатывалась применяемая ныне законодателем терминология.
--------------------------------
См.: Советское законодательство о труде: Справочник / Отв. ред. В.В. Клепцов. М.: Профиздат, 1984. С. 75. Причем авторы Справочника указывают на то, что аналогичная норма содержится в Разъяснении Госкомтруда СССР и ВЦСПС от 25 октября 1983 г.

Правила наложения взыскания

Обращает на себя внимание положение, которое в теории и практике правового регулирования труда считается аксиоматичным: при применении мер дисциплинарных взысканий важно учитывать правила наложения взыскания. А также характер самого проступка, степень его тяжести и обстоятельства, при которых он был совершен. Это положение было внесено в ТК РФ в результате изменений, внесенных в Кодекс в 2006 г. (ч. 5 ст. 192 ТК РФ). Безусловно, наложение дисциплинарного взыскания относится к компетенции работодателя. Воспользуется он этим правом или нет, зависит от каждого конкретного случая.
Таким образом, применяя п. 5 ч. 1 ст. 81 ТК РФ, работодателю необходимо обратить внимание на связь: дисциплинарный проступок - взыскание. Сказанное можно выразить схематично.

Из приведенной схемы видно: если дисциплинарный проступок совершен и к работнику применено дисциплинарное взыскание не в виде увольнения, то уволить его за этот проступок нельзя. После повторно совершенного дисциплинарного проступка (неисполнения своих трудовых обязанностей) должно последовать либо дисциплинарное взыскание в виде замечания, выговора, либо увольнение.

Причем если увольнение по п. 5 ч. 1 ст. 81 ТК РФ прекращает трудовое отношение работника с работодателем, то наложение иного дисциплинарного взыскания не прекращает трудового отношения. Поэтому за вновь совершенное трудовое правонарушение может последовать применение дисциплинарного взыскания, как в виде увольнения, так и в виде любого иного дисциплинарного взыскания из перечня дисциплинарных взысканий, перечисленных в ст. 192 ТК РФ (замечание, выговор, увольнение по соответствующим основаниям).

Нельзя не заметить, что законодатель специально закрепил положение о недопущении применения дисциплинарных взысканий, не предусмотренных федеральными законами, уставами и положениями о дисциплине. Следовательно, работодатель должен учитывать только те дисциплинарные взыскания, которые допустимы законодателем.

В этой связи, определяя "неоднократность", необходимо учитывать то, что за каждый проступок может быть применено только одно дисциплинарное взыскание. А также: если в течение года со дня применения дисциплинарного взыскания работник не будет подвергнут новому дисциплинарному взысканию, то он считается не имеющим дисциплинарного взыскания (ст. ст. 193, 194 ТК РФ). В современном Трудовом кодексе (п. 5 ч. 1 ст. 81 ТК РФ) речь идет о применении дисциплинарного взыскания в виде увольнения. Следовательно, при увольнении по данному основанию необходимо проверять правильность наложения всех дисциплинарных взысканий, которыми работодатель обосновал приказ об увольнении. Причем принимаются во внимание лишь те дисциплинарные взыскания, которые имеют в данный момент юридическое значение: не сняты досрочно, со дня наложения которых до издания приказа прошло не более 1 года и т.п. (ст. 192 ТК РФ) .
--------------------------------
Гражданское дело из архива Южно-Сахалинского городского суда. N 2-8139/2002.

Пример. Так, М. обратился в суд в связи с тем, что он был уволен по п. 5 ч. 1 ст. 81 ТК РФ 02.09.2002. Из материалов гражданского дела усматривается, что 27 августа 2001 г. приказом N 1117-к М. объявлен строгий выговор. К моменту увольнения - 02.09.2002, прошел год со дня наложения дисциплинарного взыскания, и на основании ч. 1 ст. 194 ТК РФ считается, что работник уже не имеет дисциплинарного взыскания. Иных фактов нарушения трудовой дисциплины М. до увольнения в судебном заседании не установлено. Следовательно, при данных обстоятельствах увольнение М. нельзя признать законным. Таким образом, чтобы прекращение трудового договора было правомерным, работодателю при увольнении по п. 5 ч. 1 ст. 81 ТК РФ необходимо одновременно соблюсти правила наложения дисциплинарного взыскания и соблюсти процедуру увольнения.

Литература

1. Советское законодательство о труде: Справочник / Отв. ред. В.В. Клепцов. М.: Профиздат, 1984. С. 75. (Причем авторы Справочника указывают на то, что аналогичная норма содержится в Разъяснении Госкомтруда СССР и ВЦСПС от 25 октября 1983 г.).

Автор: И.Андриановская - Доцент, завкафедрой гражданского и трудового права ЮИ Сахалинского государственного университета

Расторжение трудового договора по п. 7 ч. 1 ст. 81 ТК РФ.

Особенности расторжения трудового договора в связи с совершением виновных действий работником, непосредственно обслуживающим денежные или товарные ценности, если эти действия дают основание для утраты доверия к нему со стороны работодателя, урегулированы п. 7 ч. 1 ст. 81 ТК РФ.

Трудовой договор может быть расторгнут в связи с совершением виновных действий работником, непосредственно обслуживающим денежные или товарные ценности, если эти действия дают основание для утраты доверия к нему со стороны работодателя.

По пункту 7 ч. 1 ст. 81 ТК РФ основанием увольнения может быть совершение виновных действий работником, который непосредственно обслуживает денежные или товарные ценности. При этом расторжение трудового договора с работником по данному основанию возможно, если действия работника дают основание для утраты доверия к нему со стороны работодателя. При увольнении в связи с утратой доверия трудовой договор может быть расторгнут только с работниками, непосредственно обслуживающими денежные или товарные ценности, совершившими виновные действия, которые дают работодателю основание для утраты доверия к таким работникам.

В пункте 7 ч. 1 ст. 81 ТК РФ указано, что по данному основанию могут быть уволены работники, непосредственно обслуживающие денежные или товарные ценности. С такими работниками обычно заключаются договоры о материальной ответственности.

Постановлением Министерства труда и социального развития РФ от 31 декабря 2002 г. N 85 “Об утверждении Перечней должностей и работ, замещаемых или выполняемых работниками, с которыми работодатель может заключать письменные договоры о полной индивидуальной или коллективной (бригадной) материальной ответственности, а также типовых форм договоров о полной материальной ответственности” определяется круг лиц, с которыми может быть заключен договор о материальной ответственности. В приложении 1 к указанному Постановлению приведен Перечень должностей и работ, замещаемых или выполняемых работниками, с которыми работодатель может заключать договоры о материальной ответственности, и расширительному толкованию он не подлежит. Данный Перечень состоит из двух разделов. В первый включены соответствующие должности, а во второй – работы.

При расторжении трудового договора по основанию, предусмотренному п. 7 ч. 1 ст. 81 ТК РФ, не имеет значения, в каких размерах на работников могла быть возложена материальная ответственность за ущерб, причиненный работодателю. Тем не менее утрата доверия должна быть обоснована конкретными фактами совершения работниками виновных действий.

Причинами для утраты доверия могут служить использование работником вверенного ему для непосредственного обслуживания имущества в личных целях, получение оплаты за услуги без получения документов, обмеривание, обвешивание, обсчет, недостача, хищение, нарушение правил торговли и другие значимые обстоятельства.

Утрата доверия должна основываться на объективных доказательствах вины работника в совершении незаконных действий или причинении организации материального ущерба.

Например, если в организации работодателя розничной торговли продавцы часто забывают выдавать чеки покупателям, то с учетом сложившейся судебной практики работодателю необходимо будет доказывать суду, почему невыдача кассового чека конкретным продавцом послужила основанием для утраты к нему доверия.

В случае, когда вина работника в совершении действий, которые дают основания для утраты доверия, не доказана, то работник не может быть уволен по данному основанию, несмотря на возникновение недостачи, порчи ценностей и др.

Основание для утраты доверия к работнику может быть поводом к увольнению как в случаях, когда это нарушение было однократным, так и в случаях, когда нарушения носили систематический характер.

Работодателем при применении данного основания расторжения трудового договора должны быть учтены некоторые юридически значимые обстоятельства. Так, работник может возместить работодателю причиненные по его вине убытки. Убытков, причиненных работодателю, может и не быть при совершении работником виновных действий по обслуживанию имущества не по месту работы. Работник может также отказаться от возмещения убытков, причиненных работодателю. Такие обстоятельства следует учитывать при применении данного основания увольнения.

Исходя из применения принципа процессуальной аналогии, непризнание увольнения по данному основанию дисциплинарным взысканием при совершении указанных действий вне места работы не освобождает от обязанности учета указанных обстоятельств.

Указанные обстоятельства, которые имеют соответствующее значение для применения увольнения по п. 7 ч. 1 ст. 81 ТК РФ, должны подтверждаться относимыми, допустимыми, достоверными и достаточными доказательствами, которые должны быть получены в установленном законодательством порядке. Такие доказательства не могут быть получены без объяснений работника, совершившего виновные действия, которые дают основание для утраты к нему доверия. В связи с этим должен быть соблюден установленный для применения дисциплинарных взысканий порядок доказывания совершенного работником нарушения.

27/05/2016

Правоприменительные проблемы расторжения трудового договора по инициативе работодателя в случае ликвидации организации

Стоит отметить, что в ст. 61 ГК РФ под ликвидацией юридического лица понимается прекращение существования юридического лица без перехода в порядке универсального правопреемства его прав и обязанностей к другим лицам [1]. Ликвидация юридического лица считается завершенной, а юридическое лицо - прекратившим существование после внесения сведений о его прекращении в единый государственный реестр юридических лиц в порядке, установленном законом о государственной регистрации юридических лиц (ст. 63 ГК РФ).

Необходимо сказать, что не имеет никакого правового значения, по каким основаниям и кем ликвидируется юридическое лицо, являющееся работодателем. Для правильной юридической квалификации важен сам факт этой ликвидации.

Согласно абз. 2 п. 28 Постановление Пленума Верховного Суда РФ от 17.03.2004 N 2 "О применении судами Российской Федерации Трудового кодекса Российской Федерации" основанием для увольнения работников по пункту 1 части первой статьи 81 Кодекса может служить решение о ликвидации юридического лица, т.е. решение о прекращении его деятельности без перехода прав и обязанностей в порядке правопреемства к другим лицам, принятое в установленном законом порядке (статья 61 ГК РФ) [2].

Перейдем непосредственно к процедуре. Так, согласно ч. 2 ст. 180 ТК РФ о предстоящем увольнении в связи с ликвидацией организации работник должен быть предупрежден персонально и под роспись не менее чем за два месяца до увольнения [3].

Однако в ч. 3 этой же статьи указано, что с письменного согласия работника работодатель имеет право расторгнуть с ним трудовой договор до истечения двухмесячного срока, выплатив ему дополнительную компенсацию в размере среднего заработка работника, исчисленного пропорционально времени, оставшемуся до истечения срока предупреждения об увольнении.

Кроме того, согласно ч.1 ст. 178 ТК РФ работникам, увольняемым в связи с ликвидацией организации, выплачивается выходное пособие в размере среднего месячного заработка, а также за ними сохраняется средний месячный заработок на период трудоустройства, но не свыше двух месяцев со дня увольнения (с зачетом выходного пособия). А в исключительных случаях средний месячный заработок сохраняется за уволенным работником в течение третьего месяца со дня увольнения по решению органа службы занятости населения при условии, если в двухнедельный срок после увольнения работник обратился в этот орган и не был им трудоустроен. Такое правило установлено в части второй указанной ранее статьи.

Правила о расторжении трудового договора в связи с ликвидацией организации подлежат применению и в ситуациях, когда в установленном законодательством порядке прекращается деятельность филиала, представительства или иного обособленного структурного подразделения организации, расположенных в другой местности (ч.4 ст.81 ТК РФ) [4].

Немаловажным является тот факт, что увольнение по п. 1 ч. 1 ст. 81 ТК РФ в отличие от увольнения по иным основаниям может быть произведено в период временной нетрудоспособности работника и в период пребывания его в отпуске.

Нарушение предусмотренного законом порядка увольнения работника по п. 1 ч. 1 ст. 81 ТК РФ может является основанием для восстановления его на работе в судебном порядке. А бремя доказывания в такой ситуации возлагается на ответчика, то есть работодателя (п.28 Постановления Пленума ВС РФ) [5].

Однако тут и кроется вся суть сложившейся проблемы. Постановление Пленума не дает четкого ответа на вопрос, с какого конкретно момента работодатель вправе увольнять работника по данному основанию. Оно говорит лишь о том, что основанием для увольнения может служить решение о ликвидации. На наш взгляд данная формулировка, мягко говоря, некорректна и приводит к разного рода расхождению правоприменительной практики.

Так, в подтверждение высказанной позиции и для более детального углубления в саму суть проблемы рассмотрим ряд судебных решений, вынесенных по данной категории дел.

Часть судов указывает на правомерность увольнения работника, если запись в ЕГРЮЛ о ликвидации организации не была внесена.

Данная позиция основывается на том, что пункт 1 части 1 статьи 81 ТК РФ не указывает на то, что ликвидация должна быть завершена, достаточно принятого ликвидационной комиссией решения о ликвидации или возбуждении конкурсного производства.

В частности, Санкт-Петербургский городской суд в Апелляционном определении от 13.02.2014 N 33-2167/14 пришел к выводу, что не имеют правового значения доводы увольняемого работника о том, что увольнение произведено с нарушением законодательства, поскольку трудовой договор расторгнут до завершения ликвидации организации.

Суд при вынесении решения сослался на пункт 28 Постановления Пленума ВС РФ от 17.03.2004 N 2, согласно которому основанием для увольнения работников может служить принятое в установленном порядке решение о ликвидации юридического лица, т.е. решение о прекращении его деятельности без перехода прав и обязанностей в порядке правопреемства к другим лицам.

Аналогичную позицию поддержал суд в Апелляционном определении Орловского областного суда от 15.01.2015 N 33-15. Суд, признавая увольнение правомерным, пояснил, что, то обстоятельство, что на момент увольнения истца процедура ликвидации организации не была завершена и в ЕГРЮЛ не была внесена запись о ликвидации организации не свидетельствует о незаконности увольнения работника.

В то же время имеются противоположные выводы судов.

Суды, указывая на неправомерность увольнения работника при отсутствии соответствующей записи в ЕГРЮЛ, исходят из того, что принятие решения о ликвидации юридического лица и создание ликвидационной комиссии не имеют юридического значения, поскольку ликвидация, служащая основанием увольнения работника, не завершена.

Например, Челябинский областной суд в Апелляционном определении от 01.09.2014 N 11-9333/2014, рассматривая дело о признании увольнения работника на основании пункта 1 части 1 статьи 81 ТК РФ незаконным, установил, что поскольку определение о завершении конкурсного производства в отношении ЗАО арбитражным судом не выносилось, ликвидация указанного общества на момент увольнения работника завершена не была.

Суд указал, что поскольку ЗАО не ликвидировано, в ЕГРЮЛ запись о ликвидации ЗАО не внесена, ввиду этого, с учетом положений статей 61, 62, пункта 8 статьи 63 ГК РФ, суд пришел к обоснованному выводу о том, что ликвидация указанного предприятия на момент увольнения работника завершена не была, в связи с чем оснований для расторжения с ней трудового договора по основаниям пункту 1 части 1 статьи 81 ТК РФ не имелось.

Схожая позиция отражена и в Апелляционных определениях Челябинского областного суда от 13.11.2014 N 11-11468/2014, Иркутского областного суда от 14.06.2013 N 33-4539/13, Верховного суда Республики Саха (Якутия) от 23.01.2013 N 33-205/13.

Рассмотренные выше судебные дела являются показательными, поскольку показывают разобщенность правоприменительной практики. Можно констатировать тот факт, что один лагерь судов считает необоснованным увольнение работников до окончания ликвидации, а именно до внесения записи в ЕГРЮЛ. Другой же лагерь считает, что не важен факт окончания ликвидации, а важен сам запуск этой ликвидации, то есть принятие решения о ликвидации и назначение либо ликвидационной комиссии, либо единоличного ликвидатора.

На наш взгляд, выход из сложившейся ситуации довольно прост. Нужна корректировка формулировки Постановления Пленума ВС РФ от 17.03.2004 N 2 "О применении судами Российской Федерации Трудового кодекса Российской Федерации" на следующую: «основанием для увольнения работников по пункту 1 части первой статьи 81 Кодекса должно служить решение о ликвидации юридического лица и назначение ликвидационной комиссии, т.е. запуск процесса ликвидации, предусмотренного в установленном законом порядке».



[1] Гражданский кодекс Российской Федерации (часть первая) от 30.11.1994 N 51-ФЗ (ред. от 29.12.2017) // СЗ РФ, 05.12.1994, N 32, ст. 3301

[2] Постановление Пленума Верховного Суда РФ от 17.03.2004 N 2(ред. от 24.11.2015) "О применении судами Российской Федерации Трудового кодекса Российской Федерации" // "Бюллетень Верховного Суда РФ", N 6, 2004

[3] Трудовой кодекс Российской Федерации от 30.12.2001 N 197-ФЗ (ред. от 05.02.2018) // СЗ РФ. 2002, N 1 (ч. 1), ст. 3

[4] Трудовой кодекс Российской Федерации от 30.12.2001 N 197-ФЗ (ред. от 05.02.2018) // СЗ РФ.2002, N 1 (ч. 1), ст. 3

[5] Постановление Пленума Верховного Суда РФ от 17.03.2004 N 2(ред. от 24.11.2015) "О применении судами Российской Федерации Трудового кодекса Российской Федерации" // Бюллетень Верховного Суда РФ, N 6, 2004

Выплата пособия при увольнении: порядок и сроки

Выбрать журналАктуальные вопросы бухгалтерского учета и налогообложенияАктуальные вопросы бухгалтерского учета и налогообложения: учет в сельском хозяйствеБухгалтер Крыма: учет в унитарных предприятияхБухгалтер Крыма: учет в сельском хозяйствеБухгалтер КрымаАптека: бухгалтерский учет и налогообложениеЖилищно-коммунальное хозяйство: бухгалтерский учет и налогообложениеНалог на прибыльНДС: проблемы и решенияОплата труда: бухгалтерский учет и налогообложениеСтроительство: акты и комментарии для бухгалтераСтроительство: бухгалтерский учет и налогообложениеТуристические и гостиничные услуги: бухгалтерский учет и налогообложениеУпрощенная система налогообложения: бухгалтерский учет и налогообложениеУслуги связи: бухгалтерский учет и налогообложениеОплата труда в государственном (муниципальном) учреждении: бухгалтерский учет и налогообложениеАвтономные учреждения: акты и комментарии для бухгалтераАвтономные учреждения: бухгалтерский учет и налогообложениеБюджетные организации: акты и комментарии для бухгалтераБюджетные организации: бухгалтерский учет и налогообложениеКазенные учреждения: акты и комментарии для бухгалтераКазенные учреждения: бухгалтерский учет и налогообложениеОплата труда в государственном (муниципальном) учреждении: акты и комментарии для бухгалтераОтдел кадров государственного (муниципального) учрежденияРазъяснения органов исполнительной власти по ведению финансово-хозяйственной деятельности в бюджетной сфереРевизии и проверки финансово-хозяйственной деятельности государственных (муниципальных) учрежденийРуководитель автономного учрежденияРуководитель бюджетной организацииСиловые министерства и ведомства: бухгалтерский учет и налогообложениеУчреждения здравоохранения: бухгалтерский учет и налогообложениеУчреждения культуры и искусства: бухгалтерский учет и налогообложениеУчреждения образования: бухгалтерский учет и налогообложениеУчреждения физической культуры и спорта: бухгалтерский учет и налогообложение

20192020

НомерЛюбой

Электронная версия

Особенности увольнения сотрудника за неоднократное нарушение трудовых обязанностей (п. 5 ч. 1 ст. 81 ТК РФ).


В соответствии с п. 5 ч. 1 ст. 81 ТК РФ работодатель может уволить сотрудника в связи с неоднократным неисполнением работником без уважительных причин трудовых обязанностей, если он имеет дисциплинарное взыскание.

Указанное основание расторжения трудового договора очень часто применяют Работодатели, когда хотят избавиться от неугодного им сотрудника, не учитывая, что такое увольнение - одно из самых противоречивых из тех, что могут производится по инициативе работодателя: 

  • С одной стороны, нарушения трудовой дисциплины и трудовых обязанностей допускают в той или иной мере все сотрудники. Опоздания, оставление рабочего места, некачественно выполненная работа, невыполнение требований руководителя в срок и так далее. То есть уволить по этому основанию можно любого, если иметь резервы времени и уметь корректно оформлять необходимую документацию;

  • С другой стороны, увольнение на основании п. 5 ч. 1 ст. 81 ТК РФ очень трудоемкое: должны быть в порядке локальные нормативные акты, на которые будет ссылаться работодатель, должен четко и отлажено работать отдел HR (кадры) и/или юристы, у Работодателя должно быть понимание о сроках, формах документов и обоснование тяжести допущенных сотрудником проступков.

​В общем и целом, указанное основание таит в себе множество нюансов, а знать их все может только опытный кадровик или юрист. Одним из таких нюансов является понятие "неоднократности" в контексте увольнения за нарушение должностных обязанностей.

Понятие "неоднократность" при увольнении за нарушение трудовых обязанностей

Многие работодатели ошибочно полагают, что неоднократность нарушения должностных обязанностей заключается лишь в количестве проступков, совершенно упуская полную формулировку п. 5 ч. 1 ст. 81 ТК РФ: 

"Трудовой договор может быть расторгнут работодателем в случаях неоднократного неисполнения работником без уважительных причин трудовых обязанностей, если он имеет дисциплинарное взыскание."

Таким образом, чтобы уволить сотрудника на основании п. 5 ч. 1 ст. 81 ТК РФ, работодатель должен сперва вынести в отношении работника приказ о применении дисциплинарного взыскания, затем дождаться совершения работником еще как минимум одного нарушения,  а лишь затем увольнять его. При этом увольнение возможно только в том случае, если с момента вынесения приказа о применении предыдущего взыскания не прошло 1 года (ст. 194 ТК РФ). Тяжесть предыдущего проступка и вид наложенного взыскания значения не имеют.

Если работодатель не даёт работнику время на исправление, например, за опоздание работника на работу 1, 2 и 3-го числа, выносит 4-го числа сразу три приказа, последний из которых об увольнении, при этом у сотрудника отсутствуют непогашенные дисциплинарки, тогда увольнение по указанной статье будет неправомерным.

Советы работодателю при увольнении сотрудника по п. 5 ч. 1 ст. 81 ТК РФ

  1. Приведите в порядок или разработайте локальные нормативные акты, должностные инструкции сотрудников, ознакомьте с ними всех сотрудников под подпись. Это поможет конкретизировать должностные обязанности;

  2. Фиксируйте каждое нарушение актами и средствами фото и видеонаблюдения 

  3. Запрашивайте у сотрудников объяснительную с подробным указанием нарушения. Кроме того, не допускайте дискриминации - если опаздывает весь коллектив, а наказываете Вы только одного, это может быть использовано им в споре против Вас.

  4. Фиксируйте надлежащим образом как передачу запроса на объяснения, так и отсутствие объяснительной в установленный срок;

  5. Не забывайте о сроках применения дисциплинарного взыскания - 1 месяц с даты обнаружения, полгода с даты совершения;

  6. Используйте разработанные нами форматы документов, а лучше воспользуйтесь услугами юристов по трудовому праву или консультируйтесь кадровиков. 

Советы работнику: как избежать увольнения по статье п. 5 ч. 1 ст. 81 ТК РФ

  1. Не отказывайтесь от ознакомления и подписи каких-либо документов, наоборот подписывайте их с комментарием "Не согласен, потому что..." и далее причины несогласия. При запросе у вас объяснений подробно описывайте ситуацию, указывайте на то, что вас пытаются "выжить с работы" и так далее.

  2. Запросите у работодателя все документы, связанные с работой, локальные акты, должностную инструкцию и так далее. 

  3. Обратитесь к юристу, не тяните с этим. Срок для оспаривания увольнения - всего 1 месяц

SEC.gov | Превышен порог скорости запросов

Чтобы обеспечить равный доступ для всех пользователей, SEC оставляет за собой право ограничивать запросы, исходящие от необъявленных автоматизированных инструментов. Ваш запрос был идентифицирован как часть сети автоматизированных инструментов за пределами допустимой политики и будет обрабатываться до тех пор, пока не будут приняты меры по объявлению вашего трафика.

Пожалуйста, объявите свой трафик, обновив свой пользовательский агент, чтобы включить в него информацию о компании.

Для лучших практик по эффективной загрузке информации из SEC.gov, включая последние документы EDGAR, посетите sec.gov/developer. Вы также можете подписаться на рассылку обновлений по электронной почте о программе открытых данных SEC, включая передовые методы, которые делают загрузку данных более эффективной, и улучшения SEC.gov, которые могут повлиять на процессы загрузки по сценариям. Для получения дополнительной информации обращайтесь по адресу [email protected]

Для получения дополнительной информации см. Политику конфиденциальности и безопасности веб-сайта SEC. Благодарим вас за интерес к Комиссии по ценным бумагам и биржам США.

Идентификатор ссылки: 0.cc8e655f.1624249574.65a82557

Дополнительная информация

Политика безопасности в Интернете

Используя этот сайт, вы соглашаетесь на мониторинг и аудит безопасности. В целях безопасности и обеспечения того, чтобы общедоступная услуга оставалась доступной для пользователей, эта правительственная компьютерная система использует программы для мониторинга сетевого трафика для выявления несанкционированных попыток загрузки или изменения информации или иного причинения ущерба, включая попытки отказать пользователям в обслуживании.

Несанкционированные попытки загрузить информацию и / или изменить информацию в любой части этого сайта строго запрещены и подлежат судебному преследованию в соответствии с Законом о компьютерном мошенничестве и злоупотреблениях 1986 года и Законом о защите национальной информационной инфраструктуры 1996 года (см. Раздел 18 U.S.C. §§ 1001 и 1030).

Чтобы обеспечить хорошую работу нашего веб-сайта для всех пользователей, SEC отслеживает частоту запросов на контент SEC.gov, чтобы гарантировать, что автоматический поиск не влияет на возможность доступа других лиц к контенту SEC.gov. Мы оставляем за собой право блокировать IP-адреса, которые отправляют чрезмерные запросы. Текущие правила ограничивают пользователей до 10 запросов в секунду, независимо от количества машин, используемых для отправки запросов.

Если пользователь или приложение отправляет более 10 запросов в секунду, дальнейшие запросы с IP-адреса (-ов) могут быть ограничены на короткий период.Как только количество запросов упадет ниже порогового значения на 10 минут, пользователь может возобновить доступ к контенту на SEC.gov. Эта практика SEC предназначена для ограничения чрезмерного автоматического поиска на SEC.gov и не предназначена и не ожидается, чтобы повлиять на людей, просматривающих веб-сайт SEC.gov.

Обратите внимание, что эта политика может измениться, поскольку SEC управляет SEC.gov, чтобы гарантировать, что веб-сайт работает эффективно и остается доступным для всех пользователей.

Примечание: Мы не предлагаем техническую поддержку для разработки или отладки процессов загрузки по сценарию.

Тестирование, когда параметр находится на границе поддерживаемой гипотезы в JSTOR

Abstract

В данной статье рассматриваются задачи тестирования, в которых не выполняются некоторые стандартные условия регулярности. Мы рассматриваем случай, когда (i) векторы параметров в нулевой гипотезе могут лежать на границе поддерживаемой гипотезы и (ii) может присутствовать мешающий параметр, который появляется в альтернативной гипотезе, но не в нулевой. В статье устанавливаются асимптотические нулевые и локальные альтернативные распределения отношения квази-правдоподобия, перемасштабированного отношения квази-правдоподобия, Вальда и критериев оценки в этом случае.Результаты применимы к тестам, основанным на большом количестве оценок экстремума, и применимы к большому количеству моделей. В статье рассматриваются следующие примеры: (i) проверки нулевой гипотезы об отсутствии условной гетероскедастичности в регрессионной модели GARCH (1, 1) и (ii) проверки нулевой гипотезы о том, что некоторые случайные коэффициенты имеют дисперсию, равную нулю в случайном порядке. регрессионная модель коэффициентов с (возможно) коррелированными случайными коэффициентами.

Journal Information

Econometrica публикует оригинальные статьи по всем отраслям экономики - теоретическим и эмпирическим, абстрактным и прикладным, обеспечивая широкий охват предметной области.Он продвигает исследования, направленные на объединение теоретико-количественного и эмпирическо-количественного подходов к экономическим проблемам, которые пронизаны конструктивным и строгим мышлением. Ежегодно он исследует уникальный круг тем - от теоретических разработок во многих новых и важных областях до исследований текущих и прикладных экономических проблем, до методологически новаторских, теоретических и прикладных исследований в области эконометрики.

Информация для издателя

Эконометрическое общество - это международное сообщество, продвигающее экономическую теорию в ее отношении к статистике и математике.

% PDF-1.3 % 765 0 объект > эндобдж xref 765 58 0000000016 00000 н. 0000005549 00000 н. 0000005712 00000 н. 0000005841 00000 н. 0000005885 00000 н. 0000006294 00000 н. 0000006747 00000 н. 0000007385 00000 н. 0000017459 00000 п. 0000018482 00000 п. 0000019538 00000 п. 0000020417 00000 п. 0000021433 00000 п. 0000021989 00000 п. 0000029739 00000 п. 0000030419 00000 п. 0000030882 00000 п. 0000031470 00000 п. 0000034945 00000 п. 0000035685 00000 п. 0000036198 00000 п. 0000036619 00000 п. 0000043290 00000 н. 0000043816 00000 п. 0000044222 00000 п. 0000044617 00000 п. 0000044677 00000 п. 0000046938 00000 п. 0000047455 00000 п. 0000049085 00000 п. 0000049313 00000 п. 0000049634 00000 п. 0000049738 00000 п. 0000050019 00000 п. = \; K1z? {& 2I ث zcZKJoki ە, jc񚩌SDURZ󀝞YQ} Ko2U, A˙AkNRg.IF} 8! Q س T: RU:! Yi (Ffy (i- [C3hT ׋8 A? XX8Gmzp`C4Ӵ / (6Ya + ͔] S {| س_ wLN WJ1Ciźэ69z #

’֧ 24 QX; Tz | 'R ~ Y $ = v "mxI YX981Fx; c {: fo1J

% PDF-1.4 % 925 0 объект > эндобдж xref 925 124 0000000016 00000 н. 0000005659 00000 н. 0000005867 00000 н. 0000005903 00000 н. 0000006429 00000 н. 0000006583 00000 н. 0000006740 00000 н. 0000006894 00000 н. 0000007051 00000 н. 0000007205 00000 н. 0000007362 00000 н. 0000007519 00000 п. 0000007676 00000 н. 0000007833 00000 п. 0000007988 00000 н. 0000008637 00000 н. 0000010768 00000 п. 0000011152 00000 п. 0000011704 00000 п. 0000012127 00000 п. 0000012999 00000 н. 0000013864 00000 п. 0000014787 00000 п. 0000015658 00000 п. 0000016852 00000 п. 0000018045 00000 п. 0000018527 00000 п. 0000018587 00000 п. 0000022715 00000 п. 0000023159 00000 п. 0000023440 00000 п. 0000023882 00000 п. 0000024383 00000 п. 0000024948 00000 п. 0000025884 00000 п. 0000026752 00000 п. 0000027222 00000 п. 0000027922 00000 н. 0000029106 00000 п. 0000029190 00000 п. 0000029668 00000 п. 0000030236 00000 п. 0000030890 00000 н. 0000031358 00000 п. 0000032555 00000 п. 0000033216 00000 п. 0000035935 00000 п. 0000036754 00000 п. 0000037521 00000 п. 0000038143 00000 п. 0000038965 00000 п. 0000039758 00000 п. 0000047427 00000 п. 0000055696 00000 п. 0000062314 00000 п. 0000068488 00000 н. 0000074498 00000 п. 0000081482 00000 п. 0000081554 00000 п. 0000081770 00000 п. 0000081870 00000 п. 0000081993 00000 п. 0000082161 00000 п. 0000082325 00000 п. 0000082478 00000 п. 0000082709 00000 п. 0000082842 00000 п. 0000083021 00000 п. 0000083202 00000 п. 0000083333 00000 п. 0000083515 00000 п. 0000083697 00000 п. 0000083864 00000 п. 0000084015 00000 п. 0000084220 00000 п. 0000084407 00000 п. 0000084570 00000 п. 0000084775 00000 п. 0000084963 00000 п. 0000085126 00000 п. 0000085291 00000 п. 0000085472 00000 п. 9n + iVo, ~ ej Y_ (ꄔ LP # d'DC ڴ S * Z2V0%: P & B4L-mϽk˲ ~ {{} ܳ @ - Lj? ECZh5vFLEt? Eluu8I \ ۸ dQ (IcgON4A.M 런 | ņWm4r5 + Gc / y,? | S? '];} ΟS ߼߽> 9o͙% ~ ba {Ǟxs / t / N8 ~ n_ # | r'xIoX $> c ٬ b $ кН; ex @, & - | 8.b, $ kBP Gw1VYPDdJ''µ

Истощение вариантов человеческого гистона h2 раскрывает специфические роли в экспрессии генов и росте клеток

Цитирование: Санчо М., Дайани Э., Беато М., Иордания А (2008) Варианты истощения человеческого гистона h2 раскрывают конкретные роли в экспрессии генов и росте клеток. PLoS Genet 4 (10): e1000227. https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1000227

Редактор: Хармит С.Малик, Центр исследования рака им. Фреда Хатчинсона, Соединенные Штаты Америки

Поступила: 14 мая 2008 г .; Принята к печати: 15 сентября 2008 г .; Опубликован: 17 октября 2008 г.

Авторские права: © 2008 Sancho et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Финансирование: Эта работа была поддержана грантами Departament d'Universitats, Recerca i Societat de la Informacio (DURSI), и Ministerio de Ciencia y Tecnología (MCYT) и FEDER (SAF2002-03320). А.Дж. был назначен «Рамоном и Кахалом» от MCYT; М.С. был получателем докторской стипендии FPI от Министерства образования; ED был получателем краткосрочной стипендии Леонардо да Винчи-Unipharma от Европейского Союза.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

Введение

Эукариотическая ДНК упаковывается в хроматин благодаря своей ассоциации с гистоновыми белками. Хроматин состоит из нуклеосом. Частица ядра нуклеосомы состоит из 146 единиц пар оснований, обернутых вокруг октамера гистонов, состоящего из двух копий каждого из ядер гистоновых белков h3A, h3B, h4 и h5. Линкерный гистон h2 находится в основании нуклеосомы рядом с сайтами входа и выхода ДНК и участвует в сворачивании и стабилизации 30 нм волокна хроматина [1], [2].Количество h2 на нуклеосому очень вариабельно, и парадигма одного h2 на нуклеосому является скорее исключением, чем правилом [3]. Гистон h2 представляет собой богатый лизином белок с коротким основным N-концевым хвостом, высококонсервативным центральным глобулярным доменом и длинным положительно заряженным C-концевым хвостом. Эти хвосты модифицируются посттрансляционно, в основном за счет фосфорилирования, но также за счет ацетилирования и метилирования [4], [5]. CDK-зависимое фосфорилирование h2 происходит постепенно на протяжении клеточного цикла с максимумом во время митоза [6].

Гистон h2 у позвоночных - это семейство тесно связанных белков, кодируемых одним геном, которые демонстрируют гораздо меньшую эволюционную консервативность, чем коровые гистоны. У млекопитающих пять соматических подтипов (от h2.1 до h2.5), терминально дифференцированная экспрессируемая изоформа (h2.0), два тканеспецифических варианта (яичко h2 и ооцит h2) и недавно описанный, плохо охарактеризованный вариант h2x имеют были идентифицированы [7] - [10].

Гистон h2 участвует в позиционировании или расстоянии между нуклеосомами и формировании структуры хроматина более высокого порядка.h2-содержащий хроматин более устойчив к расщеплению нуклеазами и демонстрирует сильное ингибирование скольжения нуклеосом [11]. Следовательно, h2 рассматривается как структурный компонент, связанный с уплотнением хроматина и недоступностью для факторов транскрипции или РНК-полимеразы. Тем не менее, было высказано предположение, что гистон h2 играет более динамичную и специфичную для генов роль, участвуя в активации или репрессии экспрессии генов. Предыдущие исследования влияния истощения h2 на глобальную экспрессию генов сообщили об изменениях в экспрессии небольших групп генов, вместо того, чтобы влиять на подавляющее большинство клеточных генов [12] - [16].Эксперименты по сверхэкспрессии также внесли вклад в оспаривание концепции h2 как общего репрессора активности хроматина. У эмбрионов Xenopus laevis сверхэкспрессия соматического варианта h2 подавляла гены 5S рРНК соматического типа или другие транскрипты Pol III [17]. Сверхэкспрессия изоформ h2.0 и h2.2 увеличивает как базальный, так и индуцированный гормонами уровни транскрипта репортерного гена вируса опухоли молочной железы мыши (MMTV) [18].

Ген-специфические эффекты h2 могут быть результатом взаимодействия со специфическими регуляторными факторами или ДНК-связывающими белками.Это также может быть источником сообщений о специфических функциях некоторых вариантов h2. h2.5 кооперируется с фактором транскрипции MSX1 для ингибирования специфических промоторов-мишеней и миогенеза [19]. h2.4 участвует в процессе гетерохроматинизации. h2.4 в Lys26 деацетилируется SirT1 и впоследствии метилируется, облегчая рекрутирование комплексов Polycomb и HP1, тогда как одновременное фосфорилирование Ser27 блокирует связывание HP1 [20] - [23]. Недавно был выделен новый комплекс h2.2, действующий как репрессор р53-опосредованной транскрипции [24].Кроме того, h2.2 участвует в апоптозе, индуцированном двухцепочечными разрывами ДНК, действуя как фактор высвобождения цитохрома с, который появляется в цитоплазме после облучения рентгеновскими лучами [25].

Сильное снижение гистона h2 имеет серьезные последствия для продолжительности жизни некоторых организмов [26] - [28]. Однако у мышей с единичным или двойным нокаутом варианта h2 нет явного фенотипа из-за компенсаторной активации других подтипов [29]. Эти отчеты подтверждают мнение, что варианты h2 избыточны, лишены специфических функций в организации хроматина или контроле экспрессии генов.Выделение дополнительных подтипов не может быть полностью компенсировано повышающей регуляцией остальных подтипов [30]. Тем не менее, можно получить тройные нулевые h2.2-h2.3-h2.5 мышиные эмбриональные стволовые (ES) клетки с 50% глобальным сокращением общего h2 [12]. Электростатический эффект этого сокращения, по-видимому, компенсируется уменьшением длины повтора нуклеосом (NRL) в соответствии с ранее сообщавшейся сильной линейной зависимостью между NRL и соотношением h2 / нуклеосома (обзор в [3]) вместе с другими механизмами. такие как изменения в модификациях гистонов ядра.В этой тройной линии клеток KO ES очень ограниченное количество генов изменяет свою экспрессию. К ним относятся импринтированные гены, регулируемые метилированием ДНК, в которых специфические области CpG подвергаются пониженному метилированию в отсутствие h2 [12].

Мы ранее описали сложную роль линкерного гистона в событиях ремоделирования хроматина, происходящих в промоторе MMTV в ответ на прогестин. In vitro гистон h2 усиливает трансактивацию в одновременном присутствии рецептора прогестерона (PR) и ядерного фактора 1 (NF1).Первым шагом после начального связывания PR с экспонированными HRE является фосфорилирование гистона h2. Затем PR рекрутирует АТФ-зависимый комплекс ремоделирования хроматина, который изменяет структуру ядер нуклеосомных частиц, делая его ДНК более доступной для NF1 и дополнительного связывания PR. На последнем этапе h2 покидает промотор, чтобы обеспечить эффективную инициацию транскрипции [31], [32]. В данной работе не предпринималось попыток определить роль отдельных вариантов h2.

Чтобы дополнительно охарактеризовать in vivo роль вариантов гистона h2 и, в частности, выяснить, существует ли какая-либо функциональная специфичность, мы разработали индуцибельную экспрессирующую shРНК систему для истощения отдельных вариантов h2 в линии клеток рака молочной железы человека T47D. .Мы достигли надежного специфического ингибирования для каждого варианта, избегая эффектов компенсации, и продемонстрировали значительные различия между вариантами h2 в отношении развития клеточного цикла и экспрессии генов. С одной стороны, истощение h2.4 приводит к гибели клеток при T47D. Это первый случай, когда было отмечено, что один вариант важен для выживания в клеточном типе человека. С другой стороны, мы описываем участие h2.2 в развитии клеточного цикла. Его ингибирование вызвало остановку G1, дефекты в структуре хроматина и изменения в экспрессии специфических генов, связанных с клеточным циклом.

Материалы и методы

Клеточные линии и условия культивирования

клеточных линий с нокдауном h2 было создано из клеток T47D-MTVL (несущих одну стабильно интегрированную копию репортерного гена люциферазы, управляемого промотором MMTV; [33]). Эти клеточные линии выращивали в среде RPMI 1640 с добавлением 10% FBS 2 мМ L-глутамин, 100 Ед / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина. При необходимости добавляли доксициклин (Sigma) в дозе 2,5 мкг / мл. В течение 6-дневной обработки Dox клетки пассировали на 3-й день.При необходимости среду, содержащую сыворотку, заменяли средой без сыворотки на 4 день для остановки роста. Изображения клеточных линий h2 KD, выращенных в нормальных условиях, были получены с использованием инвертированного микроскопа Leica DMR.

Другие используемые клеточные линии выращивали следующим образом: Клеточную линию MCF-7 выращивали при 37 ° C с 5% CO 2 в среде MEM, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки, 1% пенициллин / стрептомицин, 1% заменимых аминокислот. кислоты, 1% пируват натрия и 1% глутамин. MCF10A выращивали при 37 ° C с 5% CO 2 в среде F-12 MEM, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки, 1% пенициллин / стрептомицин, 10 мкл инсулина, 10 -8 M холерный токсин, 0.5 мкг / мл гидрокортизона и 10 нг / мл EGF. HEK 293T выращивали при 37 ° C с 5% CO 2 в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM), содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки, 1% глутамина и 1% пенициллина / стрептомицина. HeLa выращивали при 37 ° C с 5% CO 2 в среде DMEM, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки и 1% пенициллин / стрептомицин.

Клонирование shRNA, производство вирусов и клеточные инфекции

Плазмиды для системы интерференции РНК, опосредованной лентивирусным вектором (pLVTHM, ptTR-KRAB-Red, pCMC-R8.91 и pMD.G) были предоставлены Д. Троно (Женевский университет) [34]. 64-мерные олигонуклеотиды для клонирования shРНК гистона h2 в pLVTHM, расщепленную MluI / ClaI, были сконструированы, отожжены и фосфорилированы, как сообщил Д. Троно (http://tronolab.epfl.ch/). Олигонуклеотиды имеют следующую общую структуру: 5'-CGCGTCCCC- N19 TTCAAGAGA- rcN19 -TTTTTGGAAAT-3 'и 5'-AGGGG- N19 -AAGTTCTCT-3 T rcN19 -AAAAAC целевая последовательность для каждого варианта h2 и rcN19 его обратная комплементарная последовательность.Соответствующие 19-мерные ген-специфические последовательности-мишени для интерференции были созданы вручную в соответствии со стандартными правилами (AAN19, GC% 30–70). Последовательности-мишени (N19): CGCTGACTCGCAGATCAAG для h2.0, AGAGCGTAGCGGAGTTTCT для h2.2, CTGCCAAGAGTCCAGCTAA для h2.3, GAAGAGCGCCAAGAAGACC для h2.4 и GGCAACTAAGAAGGCTGCC для h2.5.

Для получения вирусных частиц, содержащих векторы, производные от ВИЧ, 2,5 × 10 6 клеток HEK 293T (Clontech) трансфицировали плазмидами ptTR-KRAB-Red, pLVTHM- shh2.n или pEV833- HA-h2.n (10 мкг), pCMV-R8.91 (6,5 мкг) и pMD.G (3,5 мкг) в 10-сантиметровых чашках с использованием фосфата кальция. Среду собирали каждые 24 часа в течение 2 дней и центрифугировали 1 час 40 минут при 26000 об / мин при 4 ° C в градиенте сахарозы для концентрирования вирусов. Осадок, содержащий вирусные частицы, растворяли в среде и использовали для инфицирования клеток. Клетки инфицировали методом спинокуляции, т.е. планшеты центрифугировали при 1200 × g в течение 2 ч при 25 ° C.

Первоначально была создана клеточная линия, экспрессирующая Dox-чувствительный репрессор KRAB и RedFP (ptTR-KRAB-Red).Затем эту клеточную линию инфицировали вирусами для экспрессии кшРНК различных вариантов h2 (pLVTHM). Индуцибельные нокдаун клеточные линии сортировали в FACSvantageSE (Becton Dickinson) на RedFP-позитивную и GFP-позитивную флуоресценцию после 3 дней обработки Dox. Затем клетки амплифицировали в отсутствие Dox до проведения эксперимента.

Стабильная экспрессия вариантов h2 с меткой HA

Варианты h2 гистона человека были амплифицированы с помощью ПЦР из геномной ДНК и клонированы в вектор pCDNA4-HA, предоставленный D.Группа Рейнберга (Медицинская школа Нью-Йоркского университета). Полную кассету h2-HA клонировали в лентивирусный вектор экспрессии pEV833, предоставленный E. Verdin (Gladstone Institutes) перед кассетой IRES-GFP. Производство вируса и заражение лентивирусом, происходящим от pEV833, проводили, как описано выше. Устойчивые к shRNA h2.2 и h2.4 были созданы посредством сайт-направленного мутагенеза с помощью QuikChange Mutagenesis Kit (Stratagene). Внесенные изменения (в нижнем регистре: AGAaCGgtcCGGcGTTagT для h2.2 и GAAatctGCgAAGAAGACC для h2.4) не изменили аминокислотную последовательность.

Производство антител, специфичных к варианту h2

N-концевой домен вариантов h2 человека от h2.1 до h2.5 был использован для конструирования пептидов для продукции антител, специфичных к подтипу (рисунок S1). Пептиды были синтезированы и конъюгированы с белком-носителем, гемоцианином лимфы улитки (KLH), в лаборатории протеомики Университета Помпеу Фабра. Каждому из двух кроликов инъецировали 200 мкг пептида для каждого варианта h2 с двухнедельными интервалами, всего 4 иммунизации.Сыворотки собирали и анализировали через неделю после последней иммунизации. Антитела очищали на колонке HiTrap Protein A HP (Amersham Biosciences) в соответствии с инструкциями производителя, и некоторые из них доступны через Abcam Ltd. (Кембридж, Великобритания): h2.1 (ab17584), h2.3 (ab24174) и h2.5 ( ab24175). Второе поколение антител (включая h2.2 ab17677 и h2.5 ab18208) было получено в сотрудничестве с Abcam, начиная с двухразветвленных пептидов 2x (специфический пептид) -Lys-Cys, как описано в другом месте [35].

Экстракция белка, гель-электрофорез, иммуноблоттинг и другие методы на основе антител

Гистон h2 очищали лизисом 5% хлорной кислотой в течение 1 часа при 4 ° C. Растворимые кислые белки осаждали 30% трихлоруксусной кислотой в течение ночи при 4 ° C, дважды промывали 0,5 мл ацетона и восстанавливали в воде. Экстракты целых клеток получали, лизируя клетки в трис-HCl (pH 7,4) 25 мМ, EDTA 1 мМ, EGTA 1 мМ и SDS 1% плюс ингибиторы протеаз и фосфатаз. Концентрацию белка определяли в обоих случаях с помощью анализа белка Micro BCA (Pierce).Лизаты или очищенные белки подвергали 12% SDS-PAGE, переносили на нитроцеллюлозную мембрану, блокировали 5% обезжиренным молоком в течение 1 часа, инкубировали с первичными антителами в течение ночи при 4 ° C и вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой в течение 1 часа. при комнатной температуре. Полосы визуализировали методом хемилюминесценции с использованием системы ECL (Amersham). Количественные оценки были выполнены с помощью программного обеспечения Image Gauge (FujiFilm).

Антитела против h2.0 (ab11079), h2 фосфо-T146 (ab3596), HA-tag (ab9110) и CDC2 (ab18) были от Abcam; антитубулин был от Sigma; антитела против CDK2 (m2), CDK4 (c22), CCND1, p27 (c19), p16 (h256) и p21 (c19) были от Санта-Крус; фосфо-Rb (Ser 608) был от Cell Signaling.

Анализы иммунофлуоресценции и иммунопреципитации хроматина (ChIP) с антителом HA-tag проводили, как описано ранее [36]. CDK были иммунопреципитированы из всех клеточных экстрактов, и его киназная активность измерялась на белковых субстратах Rb или h2, как описано в других источниках [37], [38].

Рекомбинантные подтипы h2 человека были приобретены у Alexis Biochemicals (продуцированы бактериями E. coli ) или предоставлены Н. Хаппелем (Университет Геттингена) (получены на дрожжах).Рекомбинантный фрагмент 792–925 Rb был любезно предоставлен О. Бахсом (IDIBABS-UB).

Анализ клеточного цикла

Клетки промывали холодным PBS 1 ×, фиксировали в 70% этаноле и окрашивали аналитическим раствором: 3% рибонуклеаза A (Sigma) 10 мг / мл, 3% раствор A (38 мМ цитрат натрия, 500 мкг / мл пропидия иодида). в ФБС 1 ×. Образцы анализировали с использованием аппарата FACS Calibur (Becton Dickinson), программного обеспечения для анализа CellQuest и программы ModFit.

Расщепление MNase

Осадок клеток, растущих в богатой среде и обработанных или не обработанных Dox в течение 6 дней, растворяли в буфере A (10 мМ Трис-HCl, pH 7.4, 10 мМ NaCl, 3 мМ MgCl 2 , 0,3 М сахарозы и 0,2 мМ PMSF) плюс 0,2% NP40 и инкубировали в течение 10 мин при 4 ° C. Ядра получали после центрифугирования и расщепляли 2,5 единицами Mnase (Worthington) на 4 миллиона ядер в течение 25 мин при комнатной температуре в буфере A плюс 10 мМ CaCl 2 . ДНК очищали на колонке Qiagen и прогоняли на 1,2% агарозном геле.

Экстракция РНК и ОТ-КПЦР

Тотальную РНК экстрагировали с помощью набора RNAsy Kit (Qiagen). Качество РНК анализировали с помощью Agilent Bioanalyzer 2100 и набора RNA 6000 LabChip (Agilent) с помощью наноанализа Eukaryote Total RNA Nano.кДНК получали из 100 нг РНК с использованием системы синтеза первой цепи с надстрочным индексом (Invitrogen). Генные продукты анализировали с помощью кПЦР с использованием SYBR Green Mix (Roche) и специфических олигонуклеотидов в Roche 480 Lightcycler. Каждое значение было скорректировано с помощью человеческого GAPDH и выражено в относительных единицах. Каждый эксперимент проводился в трех экземплярах. Ген-специфические олигонуклеотидные последовательности доступны по запросу.

SuperArray RT-qPCR и микроматрицы

RT Profiler PCR Array (APHS-020) от SuperArray Biosciences Corporation представляет собой 96-луночный планшет, содержащий праймеры для 84 генов, связанных с клеточным циклом, плюс 5 генов домашнего хозяйства и 3 контроля качества РНК и ПЦР.Система также включает мастер-микс для конкретного инструмента и оптимизированный набор для синтеза первой цепи. Синтез первой цепи и КПЦР выполняли в соответствии с инструкциями производителя и проводили в Roche 480 Lightcycler.

Процедуры гибридизации микрочипов и анализа данных описаны в других статьях [36], [39] и подробно описаны в тексте S1.

Данные микрочипа

доступны в GEO под номерами доступа GSE11294 и GSE12299 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/index.cgi).

Результаты

Индуцибельная РНК-интерференция вариантов истощения гистона h2 в клетках рака молочной железы человека

Чтобы исследовать специфичность различных подтипов h2 в контроле экспрессии генов в клетках рака молочной железы, мы создали стабильные клеточные линии, происходящие от T47D, со сниженной экспрессией каждого из вариантов h2 в частности (от h2.0 до h2.5). h2.1 был исключен, поскольку он не экспрессируется в клетках T47D (рисунок S1). Мы использовали индуцибельную систему экспрессии shRNA, основанную на стратегии TeT-On [34].shРНК, нацеленные на дивергентные области гена, были сконструированы для специфического ингибирования вариантов h2.0, h2.2, h2.3, h2.4 и h2.5 линкерного гистона и клонированы в лентивирусном векторе pLVTHM. Линии «нокаутированных» клеток были созданы сначала путем инфицирования регуляторного вектора, который экспрессирует маркер RedFP и репрессорный слитый белок TetR-KRAB, затем вектора, кодирующего shRNA и репортерный GFP. При добавлении доксициклина (Dox) происходит дерепрессия GFP и shRNA, и целевой ген нокаутируется.Клетки, одновременно экспрессирующие RedFP и GFP при добавлении Dox, отбирали сортировкой клеток. Контрольную клеточную линию получали путем инфицирования пустым вектором pLVTHM.

Истощение различных вариантов h2 было проанализировано вестерн-блоттингом со специфическими антителами (см. Материалы и методы и рисунок S1). h2.4 был обнаружен с помощью антитела h2 фосфо-T146, показанного на рисунке S1. Вестерн-блот-анализ образца, экстрагированного h2 из каждой нокдаун клеточной линии, показал последовательное и специфическое снижение каждого варианта h2 (рис. 1A).Никаких значительных компенсационных эффектов со стороны других подтипов h2 не наблюдалось на уровне белка, но увеличение h2.0 после истощения h2.4. Эффективное истощение было достигнуто после шести дней лечения доксом (рис. 1В). Относительная количественная оценка ингибирования h2.2 вестерн-блоттингом показала 8-кратное снижение уровня белка (рис. 1C). Истощение других изоформ колеблется от 70 до 99% (рис. 1А). Электрораспылительная масс-спектрометрия препаратов h2 из всех обработанных Dox клеточных линий также показала специфическое снижение каждого подтипа h2, идентифицированного по его дифференциальной молекулярной массе (данные не показаны).

Рис. 1. Нокдаун вариантов гистона h2, опосредованный индуцируемой РНК-интерференцией, в клетках рака молочной железы человека.

Клетки-производные T47D, стабильно инфицированные лентивирусной индуцибельной системой для экспрессии shРНК против каждого из указанных вариантов гистона h2 человека, обрабатывали Dox в течение 6 дней или оставляли без лечения. (A) Истощение h2 тестировали вестерн-блоттингом с использованием специфичных для изоформ антител на препаратах гистона h2, полученных путем кислотной экстракции. h2-фосфо-T146 антитело использовали для обнаружения h2.4 (характеристики см. На Рисунке S1). Процент истощения специфической изоформы h2 при количественной оценке с помощью ленточной денситометрии показан ниже. (B) Оптимальное истощение гистона h2 достигается через 6 дней лечения Dox. Вестерн-блот-анализ истощения h2.2 на кривой времени лечения Dox. (C) Относительная количественная оценка истощения h2.2 после лечения Dox. Серийные разведения образца h2, экстрагированного из необработанных клеток, сравнивали с образцом, обработанным Dox, с помощью вестерн-блоттинга с использованием анти-h2.2 антитела. Это сравнение показывает, что h2.2 уменьшилось в 8 раз. (D) Ингибирование экспрессии h2 тестировали с помощью RT с последующей ПЦР в реальном времени (qPCR) с олигонуклеотидами, специфичными для различных генов варианта h2 человека. Данные выражены как кратное изменение (FC) экспрессии гена h2, скорректированное GAPDH в ответ на Dox, по сравнению с необработанным. Значения представляют собой среднее значение и стандартное отклонение репрезентативного эксперимента, выполненного в трех экземплярах. (E) Эффект кшРНК h2 наблюдается раньше, когда за экспрессией мРНК h2 следует ОТ-ПЦР.В этом примере показано снижение мРНК h2.2 в зависимости от времени Dox.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1000227.g001

Эффект нокдауна также измеряли с помощью обратной транскрипции и анализа ПЦР в реальном времени (RT-qPCR) экспрессии гена вариантов h2 до и после Dox обработка всех созданных клеточных линий (рис. 1D). Это показало специфическое сокращение целевого гена (от 60% до 90% в зависимости от варианта) и некоторое увеличение мРНК h2.0 в обоих h2.2 и h2.4 нокдаун клеточных линий. Значительное сокращение транскриптов вариантов h2 из-за экспрессии shRNA произошло через 2 дня после добавления Dox (рис. 1E), раньше, чем очевидное сокращение белков h2.

Влияние истощения вариантов h2 на пролиферацию клеток и развитие клеточного цикла

После обработки Dox мы наблюдали различия в скорости роста среди нокдаунов вариантов h2, в частности, клетки, истощенные по h2.2 и h2.4, не смогли достичь слияния (рис. 2A) и показали более медленную скорость роста.Для количественной оценки мы смешали в соотношении 1-1 каждую из линий клеток, экспрессирующих shRNA (RedFP и GFP-положительные после обработки Dox) с родительскими клетками T47D (RedFP и GFP-отрицательными), и мы контролировали с помощью FACS соотношение между две популяции с течением времени в культуре в присутствии Dox (рис. 2B). Медленное развитие клеток с нокдауном h2.4 наблюдалось через шесть дней после добавления Dox и клеток, истощенных по h2.2, на 9 день. На 12 день клетки с истощенным h2.5 также были менее многочисленны, чем родительские.Кроме того, на 6 день клетки h2.4 изменили морфологию в сторону некротического фенотипа (рисунок 2A и рисунок S2).

Рис. 2. Ингибирование вариантов h2 по-разному влияет на пролиферацию клеток и развитие клеточного цикла.

(A) Клетки T47D, инфицированные индуцибельной системой экспрессии shRNA против h2.2, h2.4 или пустой плазмиды, обрабатывали в течение 6 дней Dox или оставляли без обработки и наблюдали под оптической микроскопией. (B) Чтобы измерить влияние истощения h2 на пролиферацию клеток, каждую линию клеток с нокдауном h2 варианта (RFP и GFP-положительную) смешивали 1-1 с родительскими клетками T47D (RFP и GFP-отрицательными) и обрабатывали Докс.Каждые три дня клетки разделяли и процент RFP / GFP-положительных клеток измеряли с помощью FACS. Данные выражены как соотношение RFP / GFP-положительных (KD) и RFP / GFP-отрицательных (дикого типа) клеток с течением времени. Данные соответствуют репрезентативному эксперименту, выполненному в двух экземплярах. (C) Профиль клеточного цикла после окрашивания йодидом пропидия (PI) нокдауновых клеточных линий варианта h2, выращенных в течение шести дней в присутствии или в отсутствие Dox. Данные выражены в процентах клеток в фазах клеточного цикла G1, S и G2 / M.Значения представляют собой среднее значение и стандартное отклонение репрезентативного эксперимента, выполненного в трех экземплярах. (D) Нокдаун h2.4 и контрольные клетки, выращенные в присутствии Dox в течение 6 и 10 дней, были проанализированы с помощью FACS после окрашивания PI для измерения процента клеток в субG1-фазе, указывающего на гибель клеток. (E) Клетки h2.2 KD, выращенные в течение шести дней в присутствии или в отсутствие Dox и без сыворотки в течение последних двух дней, обрабатывали сывороткой и анализировали профиль клеточного цикла в указанные моменты времени. (F) Профиль клеточного цикла h2.2 клетки KD в ответ на лечение различными ингибиторами. Клетки обрабатывали или не обрабатывали доксом в течение 6 дней. Гидроксимочевина (HU) или метилметаносульфонат (MMS) добавляли в указанных концентрациях за 12 ч до анализа профиля клеточного цикла путем измерения FACS окрашенных PI клеток.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1000227.g002

Чтобы понять причины этих дефектов пролиферации, профиль клеточного цикла различных клеточных линий был исследован с помощью анализа FACS окрашенных йодидом пропидия клеток в течение шести дней. после добавления докса и по сравнению с необработанными клетками.Нокдаун клеточные линии для h2.0 и h2.3 не показали каких-либо существенных различий в профиле клеточного цикла по сравнению с неиндуцированными клетками или с контрольной клеточной линией. С другой стороны, клетки, истощенные как по h2.2, так и по h2.4, продемонстрировали резкое сокращение популяции клеток в S-фазе (рис. 2C и таблица S1). Истощение h2.5 вызвало небольшое уменьшение S-фазы. Интересно, что при нокдауне h2.2 наблюдалось увеличение пика G1 по сравнению с контролем и сопутствующее снижение пика G2. То есть истощение h2.2 вызвал остановку G1. Мы не можем исключить тот факт, что полное истощение h2.0, h2.3 или h2.5 может иметь разные эффекты.

h2.4 требуется для выживания клеток T47D

В нокдауне h2.4 наблюдалось небольшое увеличение G2 и почти не изменение G1. Хотя картина клеточного цикла была не очень драматичной, увеличение пика subG1 указывает на высокий уровень смертности в клетках, истощенных по h2.4 (рис. 2D), в соответствии с экспериментами по росту клеток. Эксперименты, проведенные для измерения апоптотических клеток (такие как образование апоптотической лестницы ДНК, связывание анексина V или тесты TUNEL), не смогли найти различий между h2.4-истощенные и контрольные клетки, что указывает на то, что гибель клеток не опосредована апоптозом (данные не показаны). Основываясь на этих результатах, мы делаем вывод, что клетки с нокдауном h2.4 демонстрируют фенотип клеточной смерти, вероятно, из-за некроза, хотя требуется более точный анализ. Вредный эффект истощения h2.4 в клетках T47D был устранен временной трансфекцией плазмиды, экспрессирующей рекомбинантный shRNA-устойчивый h2.4 (фигура S2), отбрасывая эффекты, не связанные с мишенью.

h2.2 Истощение вызывает остановку клеточного цикла в G1

Для дальнейшей характеристики фенотипа остановки G1 для h2.2-истощенных клеток, мы изучали прогрессию клеточного цикла после восстановления после блока сывороточного голодания в G1. Клетки с нокдауном h2.2 (KD), обработанные или не обработанные Dox в течение 6 дней, испытывали недостаток сыворотки в течение последних двух дней. После добавления сыворотки определяли профиль клеточного цикла через 24, 30 и 48 ч (рис. 2E и таблица S1). Необработанные Dox клетки прогрессировали в течение цикла, с максимумом клеток в S-фазе через 24 часа, в G2 / M через 30 часов и в G1 через 48 часов. Клетки, обработанные Dox, оставались заблокированными в G1-фазе с небольшим увеличением клеток в S-фазе через 30 часов после добавления сыворотки.Это указывает на то, что блок G1, вызванный истощением h2.2, является сильным, и очень немногие клетки способны убегать и продвигаться по клеточному циклу.

Гидроксимочевина (HU) и метилметаносульфонат (MMS) являются повреждающими агентами, которые блокируют циклические клетки в фазах S и S / G2 соответственно. Мы исследовали, как эти препараты влияют на профиль клеточного цикла ± Dox-обработанных клеток h2.2 и h2.4 KD. В то время как профиль клеточного цикла h2,4 KD в ответ на HU или MMS был практически неразличим в присутствии или в отсутствие Dox (данные не показаны), h2.2 клетки KD, обработанные Dox, оставались накопленными в G1 независимо от того, присутствовали ли HU или MMS (рис. 2F). Взятые вместе, наши результаты показали, что истощение h2.2 вызывает сильный фенотип остановки G1 и что клеточный цикл h2.4 KD не сильно затрагивается в немногих выживших клетках.

Задержка G1 в истощенных клетках h2.2 восстанавливается специфически путем экспрессии целевого белка

Чтобы продемонстрировать, что остановка клеточного цикла происходит именно из-за истощения h2.2, мы стабильно интегрировали в клеточную линию h2.2 KD лентивирусный вектор для экспрессии shRNA-устойчивого гена, кодирующего h2.2, на С-конце слитого с пептидом HA (rh2.2-HA). Уровни белка rh2.2-HA были аналогичны уровню эндогенного гистонового варианта, как показывает анализ вестерн-блоттинга (рис. 3А). Анализ клеточного цикла продемонстрировал, что остановка G1, наблюдаемая в клетках с истощенным h2.2, была обращена, когда присутствовал белок rh2.2-HA (рис. 3B).

Рисунок 3. Остановка G1 в h2.2 истощенные клетки возвращаются специфически за счет экспрессии целевого белка.

(A) Экспрессия HA-меченых вариантов h2 в h2.2 нокдаун клетках. Устойчивый к shRNA h2.2 и остальные варианты h2, слитые с пептидом HA на их C-концах, были введены лентивирусной инфекцией в клетки shh2.2. Экспрессию измеряли с помощью антител, специфичных к HA или варианту h2, с помощью вестерн-блоттинга. По показаниям клетки обрабатывали Dox в течение 6 дней. Окрашивание кумасси препаратов H2 показано в качестве стандарта загрузки.Показана степень экспрессии каждого варианта, меченного НА, по сравнению с rh2.2-НА (100%). h2.3-HA не может быть точно определен количественно. (B) Остановка G1 в клетках с нокдауном h2.2 восстанавливается за счет стабильной экспрессии рекомбинантного HA-меченного, устойчивого к shРНК h2.2, (C), но не за счет экспрессии других вариантов h2. Значения представляют собой среднее значение и стандартное отклонение процентного содержания клеток в каждой из фаз клеточного цикла в клетках h2.2 KD, стабильно экспрессирующих различные рекомбинантные варианты h2, обработанные или не обработанные Dox в течение 6 дней.Показаны репрезентативные эксперименты, проведенные в трех экземплярах.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1000227.g003

Более того, чтобы исключить, что фенотип не был вызван снижением общего содержания h2, мы провели эксперимент, стабильно эктопически экспрессируя каждый из других HA. -меченные варианты h2 в индуцибельной клеточной линии h2.2 KD. Включение рекомбинантных HA-меченых вариантов h2 в хроматин было протестировано несколькими способами, включая вестерн-блоттинг h2, экстрагированного из хроматина, иммунофлуоресценцию и иммунопреципитацию хроматина (рисунок S3).Экспрессия h2.4-HA и h2.5-HA была сопоставима с rh2.2-HA, уровень h2.0-HA был заметно ниже, а h2.3-HA примерно в 10 раз ниже (рис. 3A). Как показано на рисунке 3C, ни один из других вариантов не смог отменить задержку G1, вызванную истощением h2.2. Взятые вместе, это указывает на то, что вариант h2.2 специфически необходим для нормального развития клеточного цикла, и его истощение заставляет клетки накапливаться в фазе G1. Результаты комплементации h2.3-HA и, вероятно, h2.0-HA не являются окончательными из-за его более низких уровней экспрессии.

Вариантно-специфические эффекты истощения h2 в клеточной прогрессии не ограничиваются клетками T47D

Чтобы выяснить, был ли эффект делеции h2.2 и h2.4 на пролиферацию клеток специфическим для используемой клеточной линии рака молочной железы T47D, или, если это более протяженный фенотип, мы ввели индуцибельную систему экспрессии shRNA в другую молочную железу. линия клеток аденокарциномы (MCF7), линия неопухолевых эпителиальных клеток молочной железы (MCF10A), линия клеток аденокарциномы шейки матки (HeLa) и линия клеток эмбриональной почки (293T).Эффективное истощение h2.2 и h2.4 в ответ на обработку Dox было получено для всех клеточных линий в диапазоне от 63 до 95% (рис. 4A и 4B). Наблюдение за клетками in vivo под микроскопом после 6 дней обработки Dox показало, что истощение h2.2 вызвало явный дефект в росте клеток MCF7, но не на HeLa, 293T или MCF10A (рис. 4C). Интересно, что истощение h2.2 было более выраженным в MCF10A, чем в MCF-7.

Рисунок 4. Вариант-специфические эффекты истощения h2 в клеточной прогрессии не ограничиваются клетками T47D.

Клетки HeLa, 293T, MCF7 и MCF10A были инфицированы индуцибельной системой экспрессии shRNA для подавления экспрессии (A) h2.2 или (B) h2.4, и эффективность истощения линкерных гистонов была протестирована с помощью Вестерн-блоттинга с помощью специфические антитела. Клетки 293T, инфицированные пустым вектором экспрессии shRNA, показаны в качестве контроля. Процент истощения h2,2 (A) или h2,4 (B) при количественной оценке с помощью ленточной денситометрии показан ниже. Окрашивание кумасси препарата h2 показано для каждой клеточной линии h2.2 KD, где истощение нижней полосы, соответствующей h2.2 в ответ на Dox можно наблюдать. (C) Клеточные линии, инфицированные индуцибельной системой экспрессии shRNA против h2.2 или h2.4, обрабатывали в течение 6 дней Dox или оставляли без обработки и наблюдали с помощью оптической микроскопии для определения количества и морфологии прикрепленных клеток. (D) Влияние истощения h2.2 или h2.4 на пролиферацию клеток MCF7 и MCF10A измеряли, отслеживая с помощью FACS изменение соотношения между shRNA-инфицированными (GFP-положительными) и родительскими клетками (GFP-отрицательными) из Соотношение высева 1–1 в указанные дни в присутствии докса, как показано на рисунке 2B.(E) Нокдаун клетки h2.2, выращенные в присутствии Dox в течение 6 дней, анализировали с помощью FACS после окрашивания PI для измерения процента клеток в субG1-фазе, указывающего на гибель клеток.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1000227.g004

Чтобы лучше описать дефект пролиферации клеток, клетки h2.2 KD совместно культивировали 1-1 с родительскими клетками, обрабатывали Dox и рост две популяции отслеживались с помощью FACS во времени (рис. 4D). Рост MCF7 h2.2 кД, но не контроль MCF7 или MCF10A h2,2 кД, был медленнее, чем родительские клетки, и сравним с результатами, показанными для T47D h2,2 кД, показанными на рисунке 2B. Следовательно, влияние истощения h2.2 на пролиферацию клеток не ограничивалось T47D, но наблюдалось также в другой линии клеток рака молочной железы, MCF7. Однако анализ профиля клеточного цикла не показал остановки G1. Вместо этого явное увеличение пика subG1 наблюдалось в клетках MCF7 (рис. 4E). Стоит отметить, что, в отличие от T47D, клеточная линия MCF7 является p53-позитивной и, следовательно, склонна к апоптотической гибели в ответ на неблагоприятные стимулы.Это могло бы объяснить различия между двумя линиями клеток рака груди в ответ на истощение запасов h2.2.

С другой стороны, истощение h2.4 также было получено в четырех тестируемых клеточных линиях, но только в MCF10A это повлияло на пролиферацию клеток, как это произошло в T47D (рис. 4B, 4C и 4D). Примечательно, что истощение h2.4 было сильнее в клетках HeLa, но не наблюдалось никакого влияния на пролиферацию клеток. Мы не можем исключить, что более высокая эффективность истощения (например, в MCF7 h2,4 кД) приведет к дальнейшим эффектам.Тем не менее, наши результаты убедительно свидетельствуют о том, что h2.2 и h2.4 участвуют в процессах, связанных с нормальным развитием клеточного цикла, в зависимости от типа клеток.

h2.2 Нокдаун вызывает уменьшение расстояния между нуклеосомами

Пониженное содержание h2 (до 50%) в триплетных h2 нулевых мышиных эмбриональных стволовых (ES) клетках приводит к уменьшению расстояния между нуклеосомами (длины нуклеосомного повтора), как измерено после расщепления микрококковой нуклеазой (MNase) основной массы ядра хроматина [12]. Мы исследовали расстояние между нуклеосомами хроматина от различных нокдаунов h2 варианта T47D путем переваривания выделенных ядер МНКазой (рис. 5А).Истощение h2.2, но не истощение других вариантов h2, вызывало поразительное уменьшение расстояния между нуклеосомами. Рассчитанная длина повтора нуклеосомы (NRL) уменьшилась примерно с 184,7 до 173,5 после истощения h2,2 (рис. 5B, полученный в пяти независимых экспериментах). Это было неожиданно, так как h2.2 составляет только примерно 23% от общего содержания h2 в клетках T47D (рисунок S1). Поскольку истощение h2.2 достигло 90–95%, а компенсаторное увеличение экспрессии других вариантов h2 не было обнаружено, мы оценили, что общее содержание h2 уменьшилось примерно на 20%.Это было подтверждено окрашиванием кумасси препаратов h2 из клеток h2.2 KD, обработанных или не обработанных Dox (рис. S1). Стабильная экспрессия HA-меченой, устойчивой к shRNA h2.2 в клеточной линии h2.2 KD вернула уменьшение расстояния между нуклеосомами, вызванное эндогенным истощением h2.2 (рис. 5C).

Рис. 5. Нокдаун h2.2 вызывает уменьшение расстояния между нуклеосомами.

(A) Ядра из клеток с нокдауном варианта h2, обработанных или не обработанных Dox в течение 6 дней, обрабатывали MNase, и профиль основного хроматина анализировали с помощью гель-электрофореза для расчета длины повтора нуклеосом (NRL).(B) График зависимости числа нуклеосом от длины ДНК для расщепленного МНКазой основного хроматина h2.2-нокдаун клеток ± Dox. Этот график использовался для расчета соответствующего NRL. Были объединены данные 5 независимых экспериментов. Показано среднее ± стандартное отклонение. Данные для необработанных и обработанных образцов значительно различались в тесте t-Стьюдента (95% доверительный интервал со значением p 0,0001). Открытые треугольники обозначают необработанные, а закрашенные квадратные символы соответствуют клеткам, обработанным Dox в течение 6 дней. (C) Комплементация уменьшенного расстояния между нуклеосомами в h2.2 нокдаун клеток за счет стабильной экспрессии shRNA-устойчивого h2.2 (rh2.2HA).

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1000227.g005

В тройных h2 нулевых ES клетках уменьшение расстояния между нуклеосомами сопровождалось глобальными изменениями в различных посттрансляционных модификациях гистонов [12]. Модификации гистонов, такие как триметилирование K27 или триметилирование K9 в коровом гистоне h4, остаются неизменными в наших истощенных по h2.2 клетках (данные не показаны).

Уменьшенный h2.2 Контент в основном ведет к репрессии ограниченного числа генов

Истощение

h2.2 изменяет глобальную структуру хроматина, что видно по уменьшению расстояния между нуклеосомами. Это может иметь некоторое влияние на ядерные процессы, такие как репликация ДНК или экспрессия генов, и, в конечном итоге, на пролиферацию клеток. Мы изучили влияние истощения h2.2 на глобальную экспрессию генов. Для этого мы использовали изготовленную на заказ платформу микроматрицы рака молочной железы, содержащую 826 клонов кДНК (см. Текст S1), чтобы сравнить линию клеток h2.2 KD, обработанную в течение 6 дней Dox, с необработанными клетками и с контрольными клетками ± Dox.Во избежание сравнения клеток, арестованных в клеточном цикле (h2,2 KD + Dox), с клетками, обычно циклически меняющимися (h2,2 KD -Dox), все клетки были одинаково арестованы в G1 путем лишения сыворотки в течение последних двух дней ± Dox. обработка перед экстракцией РНК (рис. 2E). Истощение h2.2 вызвало изменение экспрессии ограниченного числа генов. Большинство измененных генов были репрессированы в отсутствие гистона: 11 генов были активированы, а 59 генов подавлены с кратностью изменения выше 1.4 (q≤0,1), причем ген, кодирующий h2.2 (hist1h2c), является наиболее сильно подавляемой кДНК из-за специфического действия shРНК (рис. 6). Эти изменения не наблюдались в контрольных клетках, что не учитывает влияние Dox на экспрессию генов. Это указывает на то, что h2.2, а не общий репрессор, действует прямо или косвенно как положительный регулятор экспрессии генов. Среди репрессированных генов многие из них участвуют в контроле клеточного цикла. Онтология генов определила, что 20 из 59 репрессированных генов связаны с клеточным циклом, а 10 - с делением клетки.Эта доля выше, чем можно было бы ожидать, учитывая изобилие этих категорий генов в настроенном массиве. Изменение экспрессии одного или подмножества генов клеточного цикла может вызвать остановку G1.

Рисунок 6. Гены с измененной экспрессией в клетках с нокдауном h2.2.

Указанные гены имеют повышенную или пониженную экспрессию в ≥1,4 раза в присутствии Dox по сравнению с отсутствием Dox (6 дней) a . **, q≤0,05; *, 0,05≤q≤0,1; нс, незначительно.Онтология генов b : гены, связанные с клеточным циклом, идентифицированы с помощью CC. Номенклатура генов представлена ​​в Таблице S5.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1000227.g006

Истощение различных вариантов h2 приводит к специфическим изменениям в глобальной экспрессии генов

Анализ последствий истощения h2 для глобальной экспрессии гена был распространен на другие варианты h2 с использованием микроматриц Illumina для всего генома, содержащих более 22 000 зондов (см. Текст S1).Все линии клеток KD обрабатывались или не обрабатывались Dox в течение 6 дней в двух экземплярах и задерживались в G1 за 48 часов сывороточного голодания перед экстракцией РНК. Сводная информация о количестве генов, регулируемых с повышением или понижением со кратностью изменения ≥1,4 (коэффициент ложного обнаружения q≤0,1) в каждой линии клеток KD варианта h2 после обработки Dox по сравнению с необработанными клетками, представлена ​​на рисунке 7 и в таблицах S2 и S3.

Рисунок 7. Краткое изложение анализа экспрессии генов в клетках KD варианта h2 с помощью микрочипов всего генома.

1 Количество генов с повышенной или пониженной экспрессией ≥1,4 раза (q≤0,1) в присутствии Dox по сравнению с отсутствием Dox (6 дней). 2 Количество генов, измененных только в результате истощения определенной изоформы. 3 Всего относится к генам, измененным в результате истощения некоторых изоформ h2. Гены, на которые воздействуют более чем одна изоформа, учитываются только один раз.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1000227.g007

Доля измененных генов, повышенная или пониженная регуляция, составляет от 1 до 2%, в зависимости от исследуемого варианта h2.В глобальном масштабе примерно 6% генов изменяются из-за истощения некоторых вариантов. Истощение h2 вызывает в 1,5 раза больше понижающей, чем повышающей регуляции генов. В частности, соотношение пониженного и повышенного регулирования колебалось от 1 для h2,5 до 2,7 для h2,2. Как сообщалось выше, истощение запасов h2.2 в основном приводит к подавлению регуляции генов.

Всего 533 гена были активированы за счет истощения некоторого варианта h2. Из них 443 (83%) были уникальными для одного варианта. Семьдесят генов активируются двумя вариантами h2, а 20 - тремя или четырьмя вариантами.Количество генов, подавляемых истощением какого-либо варианта, составило 812. Из них 615 (76%) регулируются однозначно, 111 генов регулируются двумя вариантами, а 86 - более чем двумя вариантами. Интересно, что h2.2, h2.3 и h2.4 были вариантами, которые продуцировали более высокую долю уникально регулируемых генов, что указывает на то, что это варианты с более специфической ролью в контроле экспрессии генов. С другой стороны, на большинство генов с пониженной регуляцией h2.0 и h2.5 KD также влияет истощение других вариантов h2.

В заключение, истощение различных вариантов h2 вызвало изменение экспрессии ограниченного числа генов, различных в каждом варианте KD h2. На большинство генов влияет один вариант h2, что подтверждает теорию о том, что изоформы h2 играют определенные роли в экспрессии генов. Тем не менее, часть генов изменяется более чем одним вариантом h2, предполагая, что также могут существовать повторяющиеся роли для вариантов h2.

Экспрессия генов, связанных с клеточным циклом, изменена в h2.2-истощенные клетки

Для дальнейшего изучения взаимосвязи между истощением h2.2 и профилем экспрессии генов клеточного цикла мы проверили экспрессию 84 генов, связанных с клеточным циклом, с помощью ПЦР RT в реальном времени с использованием платформы SuperArray (Bioscience Corporation) (рис. 8). Четырнадцать генов были значительно подавлены (более чем в 2 раза), когда h2,2 был истощен после добавления Dox в течение 6 дней в клетках с недостатком сыворотки (q≤0,5). Это число было увеличено до 24 репрессированных генов при рассмотрении ≥1,5 раза и q≤0.1, и включал 10 генов, уже идентифицированных в индивидуальных экспериментах с микрочипами: BIRC5 , CDKN3 , CDC20 , CCNB2 , CDC2 , CCNB1 , MAD2L1 и CKS РББП8 . Среди вновь идентифицированных генов были CDK2 , PCNA , MCM2 , MCM3 , MCM5 , CDKN2A (p16 INK4A ) и CDKN2B

31 INK4.Только два гена были активированы ≥2 раза: RBL2 и CCNG2 . В том же эксперименте клетки, содержащие ± Dox (6 дней) и лишенные сыворотки (последние два дня), дополнительно инкубировали с 10% сывороткой в ​​течение дополнительных 12 часов и экстрагировали РНК. Различия в экспрессии репрессированных генов были еще выше, подтверждая, что на экспрессию этого подмножества генов повлияло истощение h2.2 (рис. 8).

Рисунок 8. Гены, связанные с клеточным циклом, с измененной экспрессией в h2.2 нокдаун ячейки.

Указанные гены имеют повышенную или пониженную экспрессию в ≥1,5 раза в присутствии Dox по сравнению с отсутствием Dox (6 дней) a . **, q≤0,05; *, 0,05≤q≤0,1. Номенклатура генов представлена ​​в Таблице S6.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1000227.g008

Экспрессию некоторых из идентифицированных генов дополнительно анализировали с помощью стандартной RT-qPCR со специфическими олигонуклеотидами. Интересно, что мы обнаружили индукцию ингибитора клеточного цикла CDKN1A (p21 Cip1 ), чего не наблюдали с помощью предыдущих методов.Некоторые из генов были репрессированы ( CDC2 , CDKN3 , RFC3 ) или активированы ( CDKN1A ) уже через 2 дня после добавления Dox. Другие гены не подавлялись до 6 дня ( CDC20, ) (рисунок S4). Затем мы проверили, может ли ингибирование генов в клетках с истощенным h2.2 быть отменено стабильным повторным введением рекомбинантного h2.2 (рис. 9A). Ингибирование CDC2 , CCNB2 , CDC20 , MAD2L1 и RFC3 было отменено путем восстановления h2.2 уровня. Индукция CDKN1A (p21 Cip1 ) была только частично отменена повторным введением h2.2.

Рис. 9. Изменения генов клеточного цикла в клетках с нокдауном h2.2.

(A) Комплементация измененной экспрессии генов, связанных с клеточным циклом, в клетках с нокаутом h2.2 путем стабильной экспрессии рекомбинантного HA-меченного, устойчивого к shRNA h2.2. Экспрессию указанных генов клеточного цикла измеряли с помощью RT-qPCR со специфическими олигонуцелотидами в родительских h2,2 кД и h2.Клетки 2sh / rh2.2HA, обработанные или не обработанные Dox в течение 6 дней. Экспрессию GAPDH измеряли для нормализации. Данные выражены в относительных единицах специфического гена / GAPDH. Значения представляют собой среднее значение и стандартное отклонение репрезентативного эксперимента, выполненного в трех экземплярах. (B) Изменения в накоплении или фосфорилировании белков, связанных с клеточным циклом, при ингибировании h2.2. Экспрессию указанных белков измеряли с помощью вестерн-блоттинга со специфическими антителами в клетках, обработанных или не обработанных Dox в течение 6 дней. Нокдаун клетки h2.2 сравнивали с родительскими клетками T47D или контрольными клетками.Антитела к тубулину использовали в качестве контроля нагрузки. (C) Активность CDK2 в клетках, истощенных по h2.2. CDK2 иммунопреципитировали специфическим антителом из клеточных экстрактов Dox-обработанных или необработанных клеток (h2,2 KD или контроль) и инкубировали с гистоном h2 и γ-ATP. Продукты были разделены в SDS-PAGE и обнаружены авторадиографией. Иммунопреципитированный материал измеряли иммуноблоттингом с антителом против CDK2.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1000227.g009

Экспрессия генов, связанных с клеточным циклом, может изменяться в течение цикла.Мы исследовали влияние истощения h2.2 на экспрессию этих генов с течением времени после высвобождения из вызванного голоданием сыворотки блокады G1-ареста. В клетках с истощением h2.2 (обработанных Dox) ответ генов на сыворотку в большинстве случаев был задержанным и сниженным (рисунок S4).

Чтобы проверить, является ли репрессия этого подмножества генов клеточного цикла специфической для истощения h2.2, мы протестировали экспрессию гена в контрольных, нокдаун клетках h2.0, h2.2 и h2.4 ± Dox, параллельно, с платформу SuperArray (Таблица S4).Двадцать семь генов были репрессированы (≥1,5 раза) по сравнению с контрольными клетками ± Dox, когда h2.4 был истощен, с примерно 50% совпадением с генами, репрессированными при ингибировании h2.2. Это включало CDKN3 , MAD2L1 и CCNB2 . Только один ген был слегка активирован. С другой стороны, истощение h2.0 вызвало активацию примерно 20 генов (≥1,5 раза) и репрессию только 2 генов. Наши результаты показывают, что истощение различных вариантов h2 по-разному влияет на экспрессию генов, связанных с клеточным циклом.

Профиль белка клеточного цикла в клетках, истощенных по h2.2

Чтобы лучше охарактеризовать задержку G1, вызванную истощением h2.2, мы проанализировали накопление или фосфорилирование нескольких регуляторов клеточного цикла в ± Dox-обработанных h2.2 KD и контрольных клетках с помощью вестерн-блоттинга со специфическими антителами (рис. 9B). Фосфорирование белка ретинобластомы (Rb) является ключевым привратником перехода G1 в S через точку рестрикции клеточного цикла [40], [41]. Фосфорилирование Rb было сильно снижено в обработанном Dox h2.2 клетки KD, но не в контрольных клетках, как показано в двух разных экспериментах. Более высокий phoRb в h2,2 кД (-Dox) по сравнению с родительским T47D, наблюдаемый в эксперименте 1, не воспроизводился. Фосфорилирование Rb необходимо для транскрипции генов S-фазы, например CDC2 , PCNA и циклины E / A. Некоторые из них постоянно подавляются в h2.2 KD, например CDC2 и PCNA . Соответственно, уровень белка CDC2 был снижен в клетках h2.2 KD + Dox (фигура 9B).

Rb последовательно фосфорилируется в фазе G1 парами CDK4 / 6-циклин D1 и CDK2-циклин E. Мы не обнаружили изменений в накоплении белков Cyclin D1 или CDK4 (рис. 9B). Вместо этого уровни CDK2 были снижены в h2,2 кД, а также активность киназы, ассоциированной с CDK2, иммунопреципитированной из этих клеток (фиг. 9B и 9C). CDK2 Экспрессия гена также снижалась при истощении h2.2 (фигура 8 и таблица S4). Как и в случае с CDC2, подавление CDK2 в клетках h2.2 KD также может помочь объяснить арест G1.

В ответ на повреждение ДНК p53-зависимая индукция экспрессии ингибитора CDK p21 Cip1 участвует в дефекте фосфорилирования Rb [42]. В нашем эксперименте уровни ингибиторов CDK p21 Cip1 и p27 Kip1 не изменились (фигура 9B), хотя экспрессия гена CDKN1A была увеличена в клетках, истощенных по h2.2 (фигура 9A). Учитывая, что клетки T47D являются p53-дефектными, мы не можем исключить, что другой игрок в конечном итоге затронут h2.2, такие как ингибиторы семейства INK4, влияют на фосфорилирование Rb. Один из этих ингибиторов, p16 INK4A , не был обнаружен в наших клетках (фиг. 9B). Мы можем заключить, что остановка G1 в клетках h2.2 KD вызвана нарушением регуляции факторов клеточного цикла выше фосфорилирования Rb, но его точные причины все еще остаются для нас неуловимыми, как и, что более важно, способ, которым h2.2 управляет регуляцией. этих факторов.

Обсуждение

Гистон h2 - структурный компонент хроматина, связанный с уплотнением и недоступностью для факторов транскрипции или РНК-полимеразы.Тем не менее, было высказано предположение, что гистон h2 играет более динамичную и специфичную для генов роль, участвуя в активации или репрессии экспрессии генов. Более того, не совсем понятно, в какой степени подтипы h2 функционально избыточны или выполняют определенные функции. Предыдущие сообщения показывают, что разные варианты h2 могут иметь разные свойства и значения для экспрессии генов [8], [18], [43], [44]. Наш анализ с помощью индуцибельной РНК-интерференции позволяет исследовать фенотипические эффекты и эффекты экспрессии генов вариантно-специфического истощения h2 на линии клеток рака молочной железы человека, избегая компенсаторной регуляции других подтипов h2 или эпигенетической адаптации к изменениям структуры хроматина.Мы подтвердили, что истощение подтипов h2 изменяет экспрессию различных подмножеств генов. В частности, мы обнаружили, что истощение h2.2 ведет в основном к подавлению регуляции генов, подтверждая положительную роль этого варианта h2 в экспрессии генов, а не общую репрессивную роль.

Влияние истощения h2 на развитие клеточного цикла в типе клеток и манере, зависящей от варианта h2

Мы исследовали последствия внезапного истощения определенного подтипа h2. Мы обнаружили, что h2.2 и h2.4 играют важную роль в нормальном росте линии клеток рака груди человека в культуре. С другой стороны, 70–90% истощение подтипов h2.0, h2.3 или h2.5 было совместимо с нормальным ростом клеток. Мы не можем отрицать, что дальнейшее истощение этих изоформ может иметь дополнительные последствия. Насколько нам известно, никакие ранее описанные особенности подтипов h2 не ожидали этих результатов. h2.0 очень распространен в терминально дифференцированных клетках, в то время как соматические варианты h2 (h2.1-h2.5) присутствуют в делящихся клетках с различной численностью в зависимости от типа клеток.Интересно, что на сегодняшний день не обнаружено ни одной линии клеток человека, лишенной экспрессии h2.2 или h2.4, что подтверждает важную роль этих двух изоформ [45], [46]. Эти отчеты показывают, что все протестированные типы клеток экспрессируют h2.2 и h2.4 на высоком уровне, на каждый из которых приходится не менее 20% клеточного содержания h2. Напротив, типы клеток могут быть обнаружены там, где некоторые из других подтипов h2 не обнаруживаются или находятся на очень низких уровнях (≤5% от общего h2). Это согласуется с нашими оценками содержания H2 в пяти клеточных линиях, использованных в этом отчете.Анализ структуры вариантов h2 в клетках T47D, сочетающий гель-электрофорез и иммуноблоттинг (рисунок S1 и данные не показаны), показал, что относительный вклад подтипов в общее содержание h2 был примерно следующим: 9% для h2.0, 23% для h2 .2, 13% для h2.3, 24% для h2.4 и 31% для h2.5. С другой стороны, количество h2.5 было низким в HeLa и 293T, h2.3 не обнаруживалось в HeLa, и h2.0 почти не существует в MCF10A (Рисунок 4).

Истощение гистона h2.4 оказало сильное влияние на выживаемость клеток T47D.Эта клеточная линия функционально дефектна по р53 и каспазе-3, и, следовательно, эти клетки не подвергаются апоптозу в ответ на стресс или повреждение. Действительно, нам не удалось обнаружить признаки апоптотической смерти при истощении h2.4. Через шесть дней после индукции h2,4 кД немного клеток оставалось прикрепленными к культуральной колбе, и эти клетки проявляли некротический фенотип. Когда был проанализирован профиль клеточного цикла, было обнаружено очень мало циклических клеток, и анализ FACS идентифицировал присутствие клеток в окне subG1.Профили экспрессии генов показали изменение экспрессии значительного числа генов, связанных с клеточным циклом. Хотя наши данные предполагают, что h2.4 необходим для роста клеток T47D, на данный момент нельзя отбросить более сложное объяснение как следствие косвенных эффектов истощения h2.4, таких как результирующая повышенная экспрессия h2.0.

Истощение h2.2 в клетках T47D вызывает остановку G1 и, как следствие, медленную пролиферацию. Этот эффект специфичен для истощения h2.2, поскольку он не наблюдался в клетках KD для других вариантов и был дополнен исключительно повторным введением рекомбинантного, устойчивого к shRNA h2.2.

Эффекты истощения h2.2 или h2.4 не уникальны для линии клеток T47D, но также наблюдаются в клетках MCF7 и MCF10A, соответственно. Примечательно, что истощение h2.2 не вызывает остановку G1 в MCF7, а скорее вызывает апоптотический фенотип. Различия в генетическом фоне между клеточными линиями могут объяснять разные результаты одного и того же стресса. Например, в отличие от T47D, MCF7 является p53-положительным и склонен к апоптозу. Клеточные линии другого происхождения не проявляли фенотип клеточного цикла в ответ на h2.2 кД. Это вызывает недоумение, так как на долю h2.2 приходится почти 50% от общего содержания h2 в HeLa (рис. 4A и [46]), а также он очень распространен в 293T. Это говорит о том, что эффект истощения h2 зависит от типа клетки и не связан с относительным количеством каждого варианта в клетке, а также не коррелирует с эффективностью истощения, достигаемой за счет интерференции РНК.

Опухолевые клетки подвергаются неконтролируемой пролиферации, возникающей из-за способности обходить состояние покоя, характерное для большинства нормальных клеток из взрослых тканей [41].Истощение h2.2 блокирует пролиферативный потенциал клеток рака груди, и поэтому раскрытие основного механизма может дать представление о том, как нормальные клетки становятся онкогенными.

Влияние истощения h2.2 на расстояние между нуклеосомами и организацию хроматина

Тройные нулевые h2-2-h2.3-h2.5 мышиные эмбриональные стволовые (ES) клетки представляют снижение на 15 пар оснований в основной массе NRL хроматина [12]. Истощение h2.2 клеток рака молочной железы изменило организацию хроматина, измеренную как расстояние между нуклеосомами после контролируемого переваривания ядер МНКазой.NRL уменьшался примерно на 11 п.н. при истощении h2.2, и эффект был специфическим для этого подтипа и дополнялся экспрессией рекомбинантного h2.2. Это было неожиданно, поскольку о снижении NRL сообщалось только после значительного (на 50% или выше) снижения содержания h2 [12]. Мы подсчитали, что на долю h2.2 приходится только около 20-25% от общего содержания h2 в клетках T47D, и истощение shРНК не было полным. В наших экспериментах истощение других подтипов h2 составляет аналогичный или более высокий процент от общего h2 (h2.4 и h2.5) не влияли на структуру хроматина, указывая тем самым, что h2.2 может играть специфическую роль в организации хроматина или расстоянии между нуклеосомами.

Triple KO мышиные ES-клетки пролиферируют с той же скоростью, что и ES-клетки WT, а также обнаруживают снижение уровней некоторых модификаций коровых гистонов, а также метилирования CpG в регуляторных областях определенных генов [12]. До сих пор мы не обнаружили изменений глобальных модификаций гистонов или метилирования ДНК при истощении h2.2 (данные не показаны).Используя платформу микрочипов для измерения метилирования локусов CpG в 807 генах (включая контроль клеточного цикла, апоптоз, хромосомные X-сцепленные и импринтированные гены), мы не наблюдали значительных изменений в клетках h2.2 KD, обработанных или не обработанных Dox в течение 6 дней. дней (М. Санчо, А. Фернандес, М. Беато, М. Эстеллер, А. Джордан; неопубликованные результаты). Эпигенетические изменения для компенсации истощения h2 в ES-клетках могут потребовать более длительного времени и могут позволить клеткам выжить при селективном давлении, тогда как быстрая индукция h2.2 shRNA не позволяет проявиться эффектам компенсации до того, как прогрессирование клеток будет нарушено.

Мы еще не смогли установить причинную связь между уменьшением расстояния между нуклеосомами и остановкой клеточного цикла в фазе G1, наблюдаемой при истощении h2.2 у T47D. Изменения организации хроматина могут повлиять на развитие репликационной вилки или могут привести к повреждению участков ДНК, что приведет к ответу на повреждение. Недавно сообщалось, что клетки с истощением h2 (тройные KO-ES-клетки) обладают повышенной устойчивостью к повреждению ДНК и представляют собой гиперчувствительные контрольные точки (задержка G2 / M индуцируется при более низких дозах), что объясняется усилением передачи сигналов, генерируемых при каждом разрыве ДНК [47].Если это так, то при истощении h2.2 мы ожидаем остановки S или G2 / M в ответ на повреждающие агенты, такие как HU или MMS, соответственно. Но мы ясно показали, что G1-арест является доминирующим в отношении ареста, вызванного такими соединениями.

Истощение

h2 также может влиять на формирование и стабильность митотических хромосом. В отсутствие h2 хромосомы, собранные и реплицированные в экстрактах яиц Xenopus, не могут правильно уплотняться, что приводит к аномалиям сегрегации [48]. В тройных ЭС клетках KO мышей не было обнаружено никаких отклонений в митозе и нормальном времени деления [12].Тем не менее, уменьшение h2 приводит к общему увеличению длины теломер [47]. Остается выяснить, приводит ли избирательное истощение h2.2 к хромосомным аномалиям.

Изменения экспрессии генов клеточного цикла

Неверная организация хроматина может также вызывать изменения в экспрессии чувствительных промоторов, которые могут включать гены, имеющие отношение к пролиферации клеток. Альтернативно, h2.2 может быть специфическим регулятором некоторых конкретных промоторов. Ранее сообщалось, что h2.5 взаимодействует с фактором транскрипции MSX1 и оба рекрутируются на специфические промоторы, чтобы контролировать миогенез [19]. С другой стороны, было обнаружено, что h2.2 является частью комплекса, который репрессирует р53-опосредованную транскрипцию в клетках HeLa [24]. Имея в виду эту идею, мы исследовали, какие изменения в профилях экспрессии генов происходят при истощении различных подтипов h2. Менее 10% генов, присутствующих в настроенном микрочипе (и почти 2% на массиве всего генома), были изменены в своей экспрессии после h2.2 нокдауна и большинство из них были репрессированы. Об этом поведении сообщалось ранее [14] - [16] и оно указывает на то, что h2 действует как активный регулятор экспрессии генов, а не только как репрессор из-за его свойств уплотнения хроматина. Репрессированные гены включали соответствующую долю генов, связанных с клеточным циклом. Мы отвергаем возможность того, что это происходит из-за разного соотношения клеток в разных фазах клеточного цикла при воздействии shРНК, поскольку все популяции клеток были одинаково арестованы в G1 из-за сывороточного голодания для экспериментов по экспрессии генов.Скорее, мы обнаружили эффект депривации h2.2 на подмножество генов, связанных с клеточным циклом, некоторые из которых соответствуют фенотипу остановки G1 и могут быть связью с дефектом пролиферации клеток.

Репликативное или преждевременное, вызванное стрессом старение характеризуется поддержанием клеток в состоянии остановки роста (сравнимо с задержкой G1) за счет образования гетерохроматина в локусах генов, способствующих пролиферации (гены-мишени E2F). Недавно было высказано предположение, что изменение метаболизма гистона h2 может быть вовлечено в механизм, вызывающий клеточное старение [49].Стареющие фибробласты обнаруживают пониженные уровни связанного с хроматином эндогенного h2. В этом отчете не проясняется, играет ли потеря гистона h2 причинную роль в индукции старения или это только эффект процесса, поскольку РНК-интерференция h2 оказалась безуспешной. Наши данные предполагают, что специфическая потеря подтипа h2 из хроматина может сама по себе вызывать этот фенотип в клетках T47D, указывая на то, что потеря h2 может быть посредником между сигналами, вызывающими старение, и молекулярным ответом, приводящим к остановке роста.

Прогрессирование G1 и переход в S-фазу зависит от активности двух киназных комплексов клеточного цикла, CDK4 / 6-циклина D и CDK2-циклина E, которые работают совместно, чтобы ослабить ингибирование динамического комплекса транскрипции, который содержит ретинобластому (Rb). белок и E2F. Фосфорилирование Rb с помощью CDK4 / 6 и CDK2 диссоциирует репрессорный комплекс Rb-HDAC, обеспечивая транскрипцию ключевых генов, способствующих S-фазе, включая некоторые необходимые для репликации ДНК [40]. Нижестоящие гены, контролируемые E2F, такие как CDC2 и PCNA , репрессируются в отсутствие h2.2. Активность CDK регулируется членами семейств INK4 (p15, p16, p18, p19) или KIP / CIP (p27, p21) ингибиторов циклин-зависимых киназ, индуцированных различными агентами или условиями роста, способствующими остановке клеточного цикла, дифференцировке или апоптозу. . В клетках с нокдауном h2.2 (+ Dox) Rb остается нефосфорилированным по сравнению с клетками -Dox, что указывает на то, что причиной остановки G1 является предшествующее фосфорилирование Rb с помощью CDK. p16 INK4A , p27 Kip1 и p53-индуцибельный p21 Cip1 могут быть кандидатами для объяснения низкого фосфорилирования Rb, но мы не заметили никакой разницы в уровне любого из ингибиторов в h2.2 KD, несмотря на то, что ген CDKN1A (p21 Cip1 ) индуцируется при истощении h2.2. Необходимо проверить участие других ингибиторов семейства INK4. Уровни циклина D1 и CDK4 также остаются неизменными. Напротив, уровни CDK2 и CDC2 снижены в клетках h2.2 KD. Пара CDC2 (CDK1) -циклин E недавно участвовала в переходе G1 / S и могла замещать CDK2, и, таким образом, она также может объяснять фосфорилирование Rb [50], [51]. Снижение уровней этих двух белков может объяснять остановку клеточного цикла само по себе или в сочетании с дополнительными, но нераспознанными факторами.Среди репрессированных генов в клетках h2.2 KD есть гены, участвующие в инициации репликации, такие как гены, кодирующие CDC6, CDC45L, PCNA и несколько белков MCM. Подавление этих факторов может предотвратить переход в S-фазу и, следовательно, клетки останутся в G1. Другой набор репрессированных генов кодирует белки, участвующие в переходе G2 / M, такие как CDC2, и развитие митоза, такие как MAD2L1, CDC20 и CDC23, циклин B, авроракиназа B. Их репрессия не объясняет остановку G1, но может быть часть генной сети, совместно регулируемая h2.2 истощение.

Трудно однозначно отнести ген или группу генов к прямым мишеням истощения h2.2 или ответственным за фенотип ареста G1. Первый потребует исследования участия этого конкретного подтипа гистонов в процессе активации промотора генов-кандидатов посредством иммунопреципитации хроматина, но полученные антитела, специфичные к подтипу h2, до настоящего времени были бесполезны для этого применения. Второе потребует тестирования эффекта вмешательства в каждый ген-кандидат, связанный с клеточным циклом.Вероятно, одновременное неполное молчание нескольких генов было бы необходимо, чтобы повторить арест G1, наблюдаемый здесь [52]. Наши данные и данные, опубликованные в другом месте, указывают на то, что истощение регуляторных белков клеточного цикла, таких как CDC2, CDK2, CDC20, MCMs или PCNA, вредно для прогрессирования клеточного цикла [53] - [55].

Варианты h2 играют специфические и избыточные роли в Регламенте экспрессии генов

Глобальное профилирование экспрессии генов, объединяющее индуцируемое истощение варианта h2 и микромассивы всего генома, позволило нам определить подмножества генов, прямо или косвенно регулируемых каждым вариантом.Общее количество регулируемых генов и доля генов с повышенной или пониженной регуляцией различаются между изоформами h2. Истощение различных вариантов h2 вызвало изменение экспрессии ограниченного числа генов, различных в каждом варианте KD h2. На большинство генов (79%) влияет один вариант h2, что подтверждает теорию о том, что изоформы h2 играют определенные роли в экспрессии генов. Тем не менее, часть генов изменяется более чем одним вариантом h2, предполагая, что также могут существовать повторяющиеся роли вариантов h2 в регуляции экспрессии генов.13% генов были изменены в двух вариантах KD, и только 1% генов были затронуты (подавлены) в каждом из пяти KD. Это согласуется с недавним отчетом, показывающим, что сверхэкспрессия мышиного h2 0 и h2c (человеческие ортологи h2.0 и h2.2) изменяла ограниченное количество вариантно-специфичных генов, а также меньшее количество обычно регулируемых генов. [16]. В этом случае также происходила либо повышенная, либо понижающая регуляция генов при избыточной продукции h2, с более сильным преобладанием активируемых генов в клетках, сверхэкспрессирующих h2c, и большим количеством генов с пониженной регуляцией в клетке h2 0 . линия.Точно так же мы получили более высокое соотношение генов с пониженной и повышающей регуляцией в h2.2 KD (соотношение DW: UP = 2.7), чем в h2.0 KD (соотношение = 1.9). Это подтверждает теорию о том, что h2.0 является более сильным репрессором транскрипции, а h2.2 может играть роль активатора или посредника транскрипции. Тем не менее, если следовать этому аргументу, h2,4 и h2,5 будут еще более репрессивными (соотношение = 1,4 и 1, соответственно). Это фактически согласуется с предыдущим описанием распределения варианта гистона h2 и его способности к уплотнению.Было высказано предположение, что мышиные h2.0, h2.4 и h2.5 способствуют образованию компактного хроматина и обогащены более компактным хроматином, тогда как h2.2 конденсирует хроматин менее эффективно и обогащается менее конденсированными участками хроматина [8], [56].

Наш анализ также показал, что h2.3, и особенно h2.2 и h2.4, являются наиболее специфическими вариантами, контролирующими экспрессию генов, с большим количеством уникально регулируемых генов. Это может быть связано с необходимостью h2.2 и h2.4 в клетках рака молочной железы, о которой здесь сообщается, и с тем фактом, что на сегодняшний день не обнаружено ни одного типа клеток, в котором отсутствует какой-либо из двух вариантов.Эти две изоформы могут играть более специфические роли, тогда как другие варианты могут быть более избыточными. Это все еще предположение, и для доказательства необходимо скрестить различные нокдауны варианта h2 со всеми векторами для эктопической экспрессии рекомбинантных изоформ, меченных НА.

Принимая во внимание, что гистон h2 является глобальным компонентом хроматина, наши и предыдущие отчеты по изучению глобальных изменений экспрессии генов в ответ на истощение h2 [12] - [15], показывают, что h2 влияет на экспрессию удивительно уменьшенного числа генов.Здесь примерно 6% генов, присутствующих в микроматрице 22K-гена, демонстрируют измененную экспрессию (> 1,4 раза) при ингибировании некоторых из пяти протестированных вариантов h2. Тем не менее, не все гены, присутствующие в платформе микроматрицы, экспрессируются в этой клеточной линии рака молочной железы, растущей в используемых условиях, то есть задержка G1, вызванная сывороточным голоданием. Только около 36% генов экспрессировались выше фона (данные не показаны). Это увеличивает долю генов, на которые влияет истощение какого-либо варианта h2, до 16% экспрессируемых генов (6.6% вверх и 10% вниз регулируются истощением H2). Это уже значительное количество затронутых генов, большее, чем 0,56% экспрессируемых генов, затронутых (> 2 раза) в эмбриональных фибробластах мыши с тройным нокаутом h2, опубликованные в другом месте [12]. Если мы также рассмотрим> 2-кратную вариацию экспрессии генов для анализа данных, 2% экспрессируемых генов все еще будут затронуты при истощении некоторого варианта h2. Поразительное различие между двумя исследованиями - со всей должной осторожностью в отношении различий в применяемой процедуре анализа данных - может быть связано с индуцибельной природой использованной здесь стратегии нокдауна.Наряду с небольшим числом клеточных делений встречаются клетки с пониженным уровнем определенной изоформы. В тройном мутанте клетки были отобраны для выживания и адаптировались к новой ситуации, что позволило восстановить гипотетический базальный профиль экспрессии генов, необходимый для поддержания и развития клеток.

В заключение, наш подход к индуцибельному истощению индивидуальных вариантов h2 с использованием технологии РНК-интерференции показал, что подтипы h2 не полностью избыточны, но могут иметь дифференцированные функции в некоторых из своих ядерных ролей, включая расстояние между нуклеосомами и контроль экспрессии генов, влияя на важные клеточные функции. такие события, как распространение.

% PDF-1.5 % 4 0 obj > эндобдж 7 0 объект (Содержание) эндобдж 8 0 объект > эндобдж 11 0 объект (Обозначения) эндобдж 12 0 объект > эндобдж 15 0 объект (I Информационные меры) эндобдж 16 0 объект > эндобдж 19 0 объект (1 Информационные меры: энтропия и дивергенция) эндобдж 20 0 объект > эндобдж 23 0 объект (1.1 Энтропия) эндобдж 24 0 объект > эндобдж 27 0 объект (1.2 Энтропия: аксиоматическая характеристика) эндобдж 28 0 объект > эндобдж 31 0 объект (1.3 История энтропии) эндобдж 32 0 объект > эндобдж 35 0 объект (1.4 * Энтропия: субмодульность) эндобдж 36 0 объект > эндобдж 39 0 объект (1.5 * Энтропия: неравенство Хана и лемма Ширера) эндобдж 40 0 объект > эндобдж 43 0 объект (1.6 Дивергенция) эндобдж 44 0 объект > эндобдж 47 0 объект (1.7 Дифференциальная энтропия) эндобдж 48 0 объект > эндобдж 51 0 объект (2 информационные меры: взаимная информация) эндобдж 52 0 объект > эндобдж 55 0 объект (2.1 Расхождение: основное неравенство) эндобдж 56 0 объект > эндобдж 59 0 объект (2.2 Условное расхождение) эндобдж 60 0 объект > эндобдж 63 0 объект (2.3 Взаимная информация) эндобдж 64 0 объект > эндобдж 67 0 объект (2.4 Условная взаимная информация и условная независимость) эндобдж 68 0 объект > эндобдж 71 0 объект (2.5 Сильное неравенство в обработке данных) эндобдж 72 0 объект > эндобдж 75 0 объект (2.6 * Как избежать проблем с измеримостью?) эндобдж 76 0 объект > эндобдж 79 0 объект (3 Достаточная статистика. Непрерывность расхождений и взаимная информация) эндобдж 80 0 объект > эндобдж 83 0 объект (3.1 Достаточная статистика и обработка данных) эндобдж 84 0 объект > эндобдж 87 0 объект (3.2 Геометрическая интерпретация взаимной информации) эндобдж 88 0 объект > эндобдж 91 0 объект (3.3 Вариационные характеристики дивергенции: Донскер-Варадхан) эндобдж 92 0 объект > эндобдж 95 0 объект (3.4 Вариационные характеристики дивергенции: Гельфанд-Яглом-Перес) эндобдж 96 0 объект > эндобдж 99 0 объект (3.5 Непрерывность расходимости. Зависимость от -алгебры.) эндобдж 100 0 объект > эндобдж 103 0 объект (3.6 Вариационные характеристики и непрерывность взаимной информации) эндобдж 104 0 объект > эндобдж 107 0 объект (4 Экстремизация взаимной информации: седловая точка емкости) эндобдж 108 0 объект > эндобдж 111 0 объект (4.1 Выпуклость информационных мер) эндобдж 112 0 объект > эндобдж 115 0 объект (4.2 * Локальное поведение дивергенции) эндобдж 116 0 объект > эндобдж 119 0 объект (4.3 * Локальное поведение расхождения и информация Фишера) эндобдж 120 0 объект > эндобдж 123 0 объект (4.4 Исключение взаимной информации) эндобдж 124 0 объект > эндобдж 127 0 объект (4.5 Вместимость = информационный радиус) эндобдж 128 0 объект > эндобдж 131 0 объект (4.6 Существование caod \ (общий случай \)) эндобдж 132 0 объект > эндобдж 135 0 объект (4.7 Гауссова седловая точка) эндобдж 136 0 объект > эндобдж 139 0 объект (5 Однобуквенный.Вероятность ошибки. Скорость энтропии.) эндобдж 140 0 объект > эндобдж 143 0 объект (5.1 Экстремизация взаимной информации для источников и каналов без памяти) эндобдж 144 0 объект > эндобдж 147 0 объект (5.2 * Гауссова емкость через ортогональную симметрию) эндобдж 148 0 объект > эндобдж 151 0 объект (5.3 Информационные меры и вероятность ошибки) эндобдж 152 0 объект > эндобдж 155 0 объект (5,4 энтропии) эндобдж 156 0 объект > эндобдж 159 0 объект (5.5 Энтропия и частота ошибок символа \ (бит \)) эндобдж 160 0 объект > эндобдж 163 0 объект (5.6 Скорость взаимной информации) эндобдж 164 0 объект > эндобдж 167 0 объект (5.7 * матрицы Теплица и теорема Сег \ 366) эндобдж 168 0 объект > эндобдж 171 0 объект (6 f-расхождений: определение и свойства) эндобдж 172 0 объект > эндобдж 175 0 объект (6.1 f-расходимости) эндобдж 176 0 объект > эндобдж 179 0 объект (6.2 Неравенство обработки данных) эндобдж 180 0 объект > эндобдж 183 0 объект (6.3 Полная вариативность и проверка гипотез) эндобдж 184 0 объект > эндобдж 187 0 объект (6.4 Мотивационный пример: проверка гипотез на нескольких выборках) эндобдж 188 0 объект > эндобдж 191 0 объект (6.5 Неравенства между f-расходимостями) эндобдж 192 0 объект > эндобдж 195 0 объект (7 неравенств между \ 040f -расхождениями через объединенный диапазон) эндобдж 196 0 объект > эндобдж 199 0 объект (7.1 Неравенства через объединенный диапазон) эндобдж 200 0 объект > эндобдж 203 0 объект (7.2 Примеры) эндобдж 204 0 объект > эндобдж 207 0 объект (7.3 Совместный диапазон различных расхождений) эндобдж 208 0 объект > эндобдж 211 0 объект (II Сжатие данных без потерь) эндобдж 212 0 объект > эндобдж 215 0 объект (8 сжатий без потерь переменной длины) эндобдж 216 0 объект > эндобдж 219 0 объект (8.1 Оптимальный компрессор переменной длины, без потерь) эндобдж 220 0 объект > эндобдж 223 0 объект (8.2 Однозначно декодируемые коды, префиксные коды и коды Хаффмана) эндобдж 224 0 объект > эндобдж 227 0 объект (9 Сжатие фиксированной длины \ (почти без потерь \). Slepian-Wolf.) эндобдж 228 0 объект > эндобдж 231 0 объект (9.1 Код фиксированной длины, почти без потерь, AEP) эндобдж 232 0 объект > эндобдж 235 0 объект (9.2 Линейное сжатие) эндобдж 236 0 объект > эндобдж 239 0 объект (9.3 Сжатие с дополнительной информацией как в компрессоре, так и в декомпрессоре) эндобдж 240 0 объект > эндобдж 243 0 объект (9.4 Slepian-Wolf \ (Сжатие с дополнительной информацией только в декомпрессоре \)) эндобдж 244 0 объект > эндобдж 247 0 объект (9.5 Многоконечный Слепянский волк) эндобдж 248 0 объект > эндобдж 251 0 объект (9.6 * Исходное кодирование с помощью помощника \ (Ahlswede-K \ 366rner-Wyner \)) эндобдж 252 0 объект > эндобдж 255 0 объект (10 Сжатие стационарных эргодических источников) эндобдж 256 0 объект > эндобдж 259 0 объект (10.1 Биты эргодической теории) эндобдж 260 0 объект > эндобдж 263 0 объект (10.2 Доказательство Шеннон-Макмиллан) эндобдж 264 0 объект > эндобдж 267 0 объект (10.3 * Доказательство Биркгофа-Хинчина) эндобдж 268 0 объект > эндобдж 271 0 объект (10.4 * Теорема Синая о генераторе) эндобдж 272 0 объект > эндобдж 275 0 объект (11 Универсальное сжатие) эндобдж 276 0 объект > эндобдж 279 0 объект (11.1 Арифметическое кодирование) эндобдж 280 0 объект > эндобдж 283 0 объект (11.2 Комбинаторная конструкция Фитингофа) эндобдж 284 0 объект > эндобдж 287 0 объект (11.3 Оптимальные компрессоры для класса источников. Резервирование.) эндобдж 288 0 объект > эндобдж 291 0 объект (11,4 * Приблизительное минимаксное решение: априор Джеффри) эндобдж 292 0 объект > эндобдж 295 0 объект (11.5 Последовательное вероятностное присвоение: Кричевский-Трофимов) эндобдж 296 0 объект > эндобдж 299 0 объект (11.6 Индивидуальная последовательность и универсальное предсказание) эндобдж 300 0 объект > эндобдж 303 0 объект (Компрессор 11.7 Lempel-Ziv) эндобдж 304 0 объект > эндобдж 307 0 объект (III Проверка бинарных гипотез) эндобдж 308 0 объект > эндобдж 311 0 объект (12 Проверка бинарных гипотез) эндобдж 312 0 объект > эндобдж 315 0 объект (12.1 Проверка двоичных гипотез) эндобдж 316 0 объект > эндобдж 319 0 объект (12.2 Формулировка Неймана-Пирсона) эндобдж 320 0 объект > эндобдж 323 0 объект (12.3 теста отношения правдоподобия) эндобдж 324 0 объект > эндобдж 327 0 объект (12.4 Обратные оценки на R \ (P, Q \)) эндобдж 328 0 объект > эндобдж 331 0 объект (12.5 Границы достижимости на R \ (P, Q \)) эндобдж 332 0 объект > эндобдж 335 0 объект (12.6 Асимптотика) эндобдж 336 0 объект > эндобдж 339 0 объект (13 Асимптотика проверки гипотез I) эндобдж 340 0 объект > эндобдж 343 0 объект (13.1 Режим Штейна) эндобдж 344 0 объект > эндобдж 347 0 объект (13.2 Режим Чернова) эндобдж 348 0 объект > эндобдж 351 0 объект (13.3 Основы теории больших уклонений) эндобдж 352 0 объект > эндобдж 355 0 объект (14 Информационная проекция и Большое отклонение) эндобдж 356 0 объект > эндобдж 359 0 объект (14.1 Показатели большого отклонения) эндобдж 360 0 объект > эндобдж 363 0 объект (14.2 Информационная проекция) эндобдж 364 0 объект > эндобдж 367 0 объект (14.3 Интерпретация информационной проекции) эндобдж 368 0 объект > эндобдж 371 0 объект (14.4 Обобщение: теорема Санова) эндобдж 372 0 объект > эндобдж 375 0 объект (15 Асимптотика проверки гипотез II) эндобдж 376 0 объект > эндобдж 379 0 объект (15.1 \ (E0, E1 \) - Компромисс) эндобдж 380 0 объект > эндобдж 383 0 объект (15.2 Эквивалентные формы теоремы 15.1) эндобдж 384 0 объект > эндобдж 387 0 объект (15.3 * Последовательная проверка гипотез) эндобдж 388 0 объект > эндобдж 391 0 объект (Кодирование IV канала) эндобдж 392 0 объект > эндобдж 395 0 объект (16-канальное кодирование) эндобдж 396 0 объект > эндобдж 399 0 объект (16.1 Канальное кодирование) эндобдж 400 0 объект > эндобдж 403 0 объект (16.2 Основные результаты) эндобдж 404 0 объект > эндобдж 407 0 объект (16.3 Общие \ (слабые \) обратные границы) эндобдж 408 0 объект > эндобдж 411 0 объект (16.4 Общие границы достижимости: предварительный просмотр) эндобдж 412 0 объект > эндобдж 415 0 объект (17-канальное кодирование: границы достижимости) эндобдж 416 0 объект > эндобдж 419 0 объект (17.1 Плотность информации) эндобдж 420 0 объект > эндобдж 423 0 объект (17,2 Граница достижимости Шеннона) эндобдж 424 0 объект > эндобдж 427 0 объект (17.3 Граница проверки зависимости) эндобдж 428 0 объект > эндобдж 431 0 объект (17.4 Лемма Файнштейна) эндобдж 432 0 объект > эндобдж 435 0 объект (18 линейных кодов. Пропускная способность канала) эндобдж 436 0 объект > эндобдж 439 0 объект (18.1 Линейное кодирование) эндобдж 440 0 объект > эндобдж 443 0 объект (18,2 каналов и пропускная способность) эндобдж 444 0 объект > эндобдж 447 0 объект (18,3 границы для C; пропускная способность стационарных каналов без памяти) эндобдж 448 0 объект > эндобдж 451 0 объект (18.4 Примеры DMC) эндобдж 452 0 объект > эндобдж 455 0 объект (18.5 * Информационная стабильность) эндобдж 456 0 объект > эндобдж 459 0 объект (19 каналов с входными ограничениями. Гауссовы каналы.) эндобдж 460 0 объект > эндобдж 463 0 объект (19.1 Кодирование каналов с ограничениями ввода) эндобдж 464 0 объект > эндобдж 467 0 объект (19.2 Емкость при входном ограничении C \ (P \) =? Ci \ (P \)) эндобдж 468 0 объект > эндобдж 471 0 объект (19.3 Приложения) эндобдж 472 0 объект > эндобдж 475 0 объект (19,4 * Нестационарный AWGN) эндобдж 476 0 объект > эндобдж 479 0 объект (19.5 * стационарный аддитивный цветной канал гауссовского шума) эндобдж 480 0 объект > эндобдж 483 0 объект (19.6 * Канал аддитивного белого гауссовского шума с межсимвольной интерференцией) эндобдж 484 0 объект > эндобдж 487 0 объект (19,7 * гауссовские каналы с ограничениями по амплитуде) эндобдж 488 0 объект > эндобдж 491 0 объект (19,8 * гауссовские каналы с затуханием) эндобдж 492 0 объект > эндобдж 495 0 объект (20 решеточных кодов \ (по О. Ордентлиху \)) эндобдж 496 0 объект > эндобдж 499 0 объект (20.1 Определения решетки) эндобдж 500 0 объект > эндобдж 503 0 объект (20.2 Первая попытка увеличения пропускной способности AWGN) эндобдж 504 0 объект > эндобдж 507 0 объект (20.3 Вложенные коды решетки / Созвездия Вороного) эндобдж 508 0 объект > эндобдж 511 0 объект (20.4 Кодирование грязной бумаги) эндобдж 512 0 объект > эндобдж 515 0 объект (20.5 Построение хороших пар вложенных решеток) эндобдж 516 0 объект > эндобдж 519 0 объект (21-канальное кодирование: энергия на бит, каналы с непрерывным временем) эндобдж 520 0 объект > эндобдж 523 0 объект (21,1 энергии на бит) эндобдж 524 0 объект > эндобдж 527 0 объект (21.2 Что такое N0?) эндобдж 528 0 объект > эндобдж 531 0 объект (21.3 Пропускная способность канала AWGN с непрерывным временным ограничением) эндобдж 532 0 объект > эндобдж 535 0 объект (21.4 Пропускная способность канала AWGN с непрерывным временем и неограниченной полосой частот) эндобдж 536 0 объект > эндобдж 539 0 объект (21,5 Емкость на единицу стоимости) эндобдж 540 0 объект > эндобдж 543 0 объект (22 Расширенное кодирование каналов. Разделение источника и канала.) эндобдж 544 0 объект > эндобдж 547 0 объект (22.1 Сильный Конверс) эндобдж 548 0 объект > эндобдж 551 0 объект (22.2 Стационарный канал без памяти без сильного разговора) эндобдж 552 0 объект > эндобдж 555 0 объект (22.3-канальная дисперсия) эндобдж 556 0 объект > эндобдж 559 0 объект (22,4 нормализованная скорость) эндобдж 560 0 объект > эндобдж 563 0 объект (22.5 Совместное кодирование исходного канала) эндобдж 564 0 объект > эндобдж 567 0 объект (23-канальное кодирование с обратной связью) эндобдж 568 0 объект > эндобдж 571 0 объект (23.1 Обратная связь не увеличивает пропускную способность для стационарных каналов без памяти) эндобдж 572 0 объект > эндобдж 575 0 объект (23.2 * Альтернативное доказательство теоремы 23.1 и направленной информации Месси) эндобдж 576 0 объект > эндобдж 579 0 объект (23.3 Когда обратная связь действительно полезна?) эндобдж 580 0 объект > эндобдж 583 0 объект (24 кода достижения емкости через конкатенацию Форни) эндобдж 584 0 объект > эндобдж 587 0 объект (24.1 Показатели ошибки) эндобдж 588 0 объект > эндобдж 591 0 объект (24.2 Достижение полиномиально малой вероятности ошибки) эндобдж 592 0 объект > эндобдж 595 0 объект (24.3 Составные коды) эндобдж 596 0 объект > эндобдж 599 0 объект (24.4 Достижение экспоненциально малой вероятности ошибки) эндобдж 600 0 объект > эндобдж 603 0 объект (V сжатие данных с потерями) эндобдж 604 0 объект > эндобдж 607 0 объект (25 Теория скоростных искажений) эндобдж 608 0 объект > эндобдж 611 0 объект (25.1 Скалярное квантование) эндобдж 612 0 объект > эндобдж 615 0 объект (25.2 Теоретико-информационное векторное квантование) эндобдж 616 0 объект > эндобдж 619 0 объект (25,3 * Преобразование избыточных искажений в среднее) эндобдж 620 0 объект > эндобдж 623 0 объект (26 Скоростное искажение: границы достижимости) эндобдж 624 0 объект > эндобдж 627 0 объект (26.1 Резюме) эндобдж 628 0 объект > эндобдж 631 0 объект (26.2 Теорема Шеннона скорость-искажение) эндобдж 632 0 объект > эндобдж 635 0 объект (26.3 * Лемма о покрытии) эндобдж 636 0 объект > эндобдж 639 0 объект (27 Оценка R \ (D \).Разделение источника и канала с потерями.) эндобдж 640 0 объект > эндобдж 643 0 объект (27.1 Оценка R \ (D \)) эндобдж 644 0 объект > эндобдж 647 0 объект (27.2 * Аналог свойства седловой точки в соотношении скорость-искажение) эндобдж 648 0 объект > эндобдж 651 0 объект (27.3 Совместное кодирование канала источника с потерями) эндобдж 652 0 объект > эндобдж 655 0 объект (27.4 Чего не хватает классическому сжатию с потерями?) эндобдж 656 0 объект > эндобдж 659 0 объект (VI Расширенные темы) эндобдж 660 0 объект > эндобдж 663 0 объект (28 приложений к теории статистических решений) эндобдж 664 0 объект > эндобдж 667 0 объект (28.1 Fano, LeCam и минимаксные риски) эндобдж 668 0 объект > эндобдж 671 0 объект (28.2 Метод взаимной информации) эндобдж 672 0 объект > эндобдж 675 0 объект (29 каналов множественного доступа) эндобдж 676 0 объект > эндобдж 679 0 объект (29.1 Проблемная мотивация и основные результаты) эндобдж 680 0 объект > эндобдж 683 0 объект (29.2 Граница достижимости MAC) эндобдж 684 0 объект > эндобдж 687 0 объект (Подтверждение емкости 29,3 MAC) эндобдж 688 0 объект > эндобдж 691 0 объект (30 примеров MAC. Максимальная Pe и пропускная способность без ошибок.) эндобдж 692 0 объект > эндобдж 695 0 объект (30.1 Резюме) эндобдж 696 0 объект > эндобдж 699 0 объект (30.2 Ортогональный MAC) эндобдж 700 0 объект > эндобдж 703 0 объект (30,3 BSC MAC) эндобдж 704 0 объект > эндобдж 707 0 объект (30.4 Сумматор MAC) эндобдж 708 0 объект > эндобдж 711 0 объект (30,5 множитель MAC) эндобдж 712 0 объект > эндобдж 715 0 объект (30,6 ПДК сокращения) эндобдж 716 0 объект > эндобдж 719 0 объект (30,7 гауссовского MAC) эндобдж 720 0 объект > эндобдж 723 0 объект (30.8 Особенности MAC) эндобдж 724 0 объект > эндобдж 727 0 объект (31 генератор случайных чисел) эндобдж 728 0 объект > эндобдж 731 0 объект (31.1 Настройка) эндобдж 732 0 объект > эндобдж 735 0 объект (31,2 конверс) эндобдж 736 0 объект > эндобдж 739 0 объект (Конструкция 31.3 Элиасом ГСЧ из компрессоров без потерь) эндобдж 740 0 объект > эндобдж 743 0 объект (31.4 Повторная схема Переса фон Неймана) эндобдж 744 0 объект > эндобдж 747 0 объект (31,5 фабрика Бернулли) эндобдж 748 0 объект > эндобдж 751 0 объект (31.6 Связанные проблемы) эндобдж 752 0 объект > эндобдж 755 0 объект (32 Метод энтропии в комбинаторике и геометрии) эндобдж 756 0 объект > эндобдж 759 0 объект (32.ODjDMˉT $ ɒ | 1yvll:, x} 1? I \ & SN, {i55 ('3E.7Y2P! ") NLEIHa ټ dk [) ۦ XS] sMʮ / U [Vʯ + lRB) 5IL $! + Әs8], 4 ڬ vtˮ'xQAFҠ, [ uY \ vQ! Ԏy1 LHOuv4Z $ g> R qPX $ U # $ `++ 8`M5 (LOa% sYlWT'w)> 6cZ +% d (OrV

Public Rights of Way Данные и заявления ГИС - свобода информационного запроса в совет Бата и Северо-Восточного Сомерсета

  • OutsideBath.ID

    6K Скачать

  • OutsideBath.MAP.txt

    652 тыс. Скачать Просмотреть как HTML

  • OutsideBath.TAB.txt

    0K Скачать Просмотреть как HTML

  • Запрошенная инфо 1573.pdf

    113 тыс. Скачать Просмотреть как HTML

  • ВнутриBath.DAT

    74 тыс. Скачать

  • InsideBath.ID

    1K Скачать

  • ВнутриВанны.MAP.txt

    64 КБ Скачать Просмотреть как HTML

  • InsideBath.TAB.txt

    0K Скачать Просмотреть как HTML

  • OutsideBath.DAT

    238 тыс. Скачать

Уважаемый мистер Уиттакер,

Надеюсь, что мы ответили на ваши вопросы, однако если у вас есть
Если у Вас возникнут другие вопросы, не стесняйтесь обращаться к нам.

Если вы недовольны ответом на ваш запрос, вы можете попросить
для внутренней проверки в течение 40 рабочих дней с момента получения этого запроса. Пожалуйста
, свяжитесь с г-ном Джеффом Врингом, директором по обслуживанию - One West, в Lewis House,
Manvers St, Bath BA1 1JG [1] mailto: [адрес электронной почты].

Если вы не удовлетворены результатами внутренней проверки, у вас есть
право подать апелляцию непосредственно к Уполномоченному по информации по вопросам
решение.С Комиссаром по информации можно связаться в Wycliffe House,
Water Lane, Wilmslow, Cheshire, SK9 5AF [2] www.ico.org.uk

См. Заявление об отказе от ответственности в отношении повторного использования, которое можно найти на
Сайт Совета:

[3] http: //www.bathnes.gov.uk/services/your -...

С уважением

Группа управления информацией

Один Запад

Бат и Совет Северо-Восточного Сомерсета

Телефон: 01225 396658

[4] www.Bathnes.gov.uk

Бат и Северо-Восточный Сомерсет - место, где можно жить, работать и посещать

Пожалуйста, обратите внимание на окружающую среду, прежде чем печатать это электронное письмо

От: Роберт Уиттакер <[электронная почта FOI № 611632]>

Отправлено: 14 Октябрь 2019 09:04

Кому: Информационное управление

Тема: Запрос о свободе информации - публичные права
Путь к данным и заявлениям ГИС

Дорогой Бат и Совет Северо-Восточного Сомерсета,

В соответствии с Положением об экологической информации я хотел бы запросить
копия:

1 / Оцифрованная версия / рабочая копия вашей окончательной карты общественного пользования
Права проезда, сохраненные для использования

в приложении ГИС или интерактивной онлайн-карте.Мое предпочтение Формат
для этих данных ГИС будет

один из файлов KML, GeoJSON, MapInfo или Shapefile. (Я понимаю, что эти данные
не настоящая окончательная карта, а

просто неофициальное его представление, которое может содержать ошибки. Но
, что подходит для моих целей.)

2 / Ваши окончательные заявления об общественных правах проезда, при условии, что они
хранится в цифровой форме (либо

сканированных копий или исходных цифровых версий).Я бы предпочел информацию
в многоразовом (компьютер

читаемый) формат. Если полная информация о выписке уже содержится
в данных ГИС, предоставленных для части

1, то это удовлетворит эту часть запроса, и нет необходимости
предоставить что-либо отдельно.

3 / На вашей онлайн-карте я вижу, что ссылочные номера для ваших прав
Пути принимают вид

"CL3 / 31". Прав ли я, предполагая, что часть перед
косая черта - это приход (или аналогичный)

какой-то идентификатор, а число после косой черты справа от
Номер пути внутри этого

волость / площадь? Если этого еще нет в данных, представленных в пункте 1
или 2, не могли бы вы также предоставить список

названия прихода / района, которому соответствует каждый из кодов префикса
в?

Во-вторых, в соответствии с Положением о повторном использовании информации государственного сектора, I
запрашивает разрешение

, чтобы повторно использовать указанную выше информацию в соответствии с лицензией Open Government License v3.В
целей, для которых

Информация

должна использоваться повторно, чтобы: (а) помочь улучшить отображение
Права проезда в OpenStreetMap,

и (b), чтобы преобразовать наборы данных в более удобный формат, а затем сделать
их доступно для других

для повторного использования по открытой лицензии.

С уважением,

Роберт Уиттакер

показать процитированные разделы

Отсканировано шлюзом электронной почты Clearswift SECURE.

www.clearswift.com

Список литературы

Видимые ссылки
1. mailto: [адрес электронной почты]
2. http://www.ico.org.uk/
3. http://www.bathnes.gov.uk/services/your -...
4. http://www.bathnes.gov.uk/

.