Содержание

Государственная служба | Уполномоченный по правам ребенка в Новосибирской области

 

Федеральное законодательство в сфере государственной гражданской службы:
 

  • Федеральный закон от 27.07.2004 № 79-ФЗ «О государственной гражданской службе Российской Федерации»
  • Федеральный закон от 27.05.2003 № 58-ФЗ «О системе государственной службы Российской Федерации»
  • Указ Президента РФ от 12.08.2002 № 885 «Об утверждении общих принципов служебного поведения государственных служащих»
  • Указ Президента РФ от 01.02.2005 № 110 «О проведении аттестации государственных гражданских служащих Российской Федерации»
  • Указ Президента РФ от 01.02.2005 № 111 «О порядке сдачи квалификационного экзамена государственными гражданскими служащими Российской Федерации и оценки их знаний, навыков и умений (профессионального уровня)»
  • Указ Президента РФ от 01.02.2005 № 112 «О конкурсе на замещение вакантной должности государственной гражданской службы Российской Федерации»
  • Указ Президента РФ от 01. 02.2005 г. № 113 «О порядке присвоения и сохранения классных чинов государственной гражданской службы Российской Федерации федеральным государственным гражданским служащим»
  • Постановление Правительства РФ от 08.09.2010 № 700 «О порядке сообщения работодателем при заключении трудового договора с гражданином, замещавшим должности государственной или муниципальной службы, перечень которых устанавливается нормативными правовыми актами Российской Федерации, в течение 2 лет после его увольнения с государственной или муниципальной службы о заключении такого договора представителю нанимателя (работодателю) государственного или муниципального служащего по последнему месту его службы»
  • Постановление Правительства Российской Федерации от 19.09.2013 № 822 «Об утверждении Правил предоставления государственному гражданскому служащему в случае отсутствия вакантных должностей в государственном органе, в котором сокращаются должности государственной гражданской службы, или государственном органе, которому переданы функции упраздненного государственного органа, вакантной должности государственной гражданской службы в иных государственных органах»
  • Приказ Министерства здравоохранения и социального развития РФ от 14. 12.2009 г. № 984н «Об утверждении Порядка прохождения диспансеризации государственными гражданскими служащими Российской Федерации и муниципальными служащими, перечня заболеваний, препятствующих поступлению на государственную гражданскую службу Российской Федерации и муниципальную службу или её прохождению, а также формы заключения медицинского учреждения»

Законодательство Новосибирской области в сфере государственной гражданской службы:

  • Закон Новосибирской области от 01.02.2005 № 265-ОЗ «О государственной гражданской службе Новосибирской области»
  • Закон Новосибирской области от 06.04.2005 № 287-ОЗ «О Реестре должностей государственной гражданской службы Новосибирской области»
  • Постановление администрации Новосибирской области от 16.07.2005 № 52 «О Примерных должностных регламентах государственных гражданских служащих Новосибирской области»
  • Постановление Губернатора Новосибирской области от 14.10.2005 № 553 «Об утверждении порядка и условий командирования государственного гражданского служащего Новосибирской области, порядка и условий возмещения расходов, связанных с переездом государственного гражданского служащего Новосибирской области при переводе в другой государственный орган»
  • Постановление Губернатора Новосибирской области от 21. 10.2005 № 568 «Об утверждении Порядка и условий выплаты единовременного поощрения государственным гражданским служащим Новосибирской области»
  • Постановление главы администрации (Губернатора) Новосибирской области от 20.04.2005 №248 «О форме служебного контракта о прохождении государственной гражданской службы Новосибирской области и замещении должности государственной гражданской службы Новосибирской области»
  • Постановление Губернатора Новосибирской области от 17.01.2006 № 3 «О проведении квалификационных экзаменов»
  • Постановление Губернатора Новосибирской области от 20.04.2006 № 185 «Об утверждении Положения о кадровом резерве на государственной гражданской службе Новосибирской области» (Документ утратил силу в связи с изданием постановления Губернатора Новосибирской области от 17.03.2014 №40)
  • Распоряжение Губернатора Новосибирской области от 25.12.2006 № 481-р «Об использовании услуг мобильной (сотовой) связи в областных и территориальных исполнительных органах государственной власти Новосибирской области»
  • Постановление Губернатора Новосибирской области от 13.
    12.2007 № 487 «О порядке утверждения индивидуальных планов профессионального развития государственных гражданских служащих Новосибирской области»
  • Постановление Губернатора Новосибирской области от 28.12.2007 № 512 «О Порядке утверждения, финансирования и исполнения государственного заказа на профессиональную переподготовку, повышение квалификации и стажировку государственных гражданских служащих Новосибирской области»
  • Постановление Губернатора Новосибирской области от 10.12.2007 №482 «Об утверждении Правил исчисления денежного содержания государственных гражданских служащих Новосибирской области»
  • Постановление Губернатора Новосибирской области от 13.07.2007 № 285 «Об утверждении Положения об оплате труда в органах государственной власти Новосибирской области, государственных органах Новосибирской области»
  • Постановление Губернатора Новосибирской области от 17.05.2007 № 206 «Об утверждении Положения об оплате труда работников, замещающих должности, не являющиеся должностями государственной гражданской службы Новосибирской области, в органах государственной власти Новосибирской области и государственных органах Новосибирской области»
  • Постановление Губернатора Новосибирской области от 06. 10.2008 №399 «Об утверждении Порядка ведения Реестра государственных гражданских служащих Новосибирской области»
  • Постановление Губернатора Новосибирской области от 04.08.2008 № 302 «Об утверждении Положения о порядке назначения, выплаты и перерасчета пенсии за выслугу лет государственным гражданским служащим Новосибирской области»
  • Постановление Губернатора Новосибирской области от 26.01.2009 № 23 «О порядке предварительного уведомления»
  • Постановление Губернатора Новосибирской области от 03.08.2009 № 333 «О представлении гражданами, претендующими на замещение должностей государственной гражданской службы Новосибирской области, и государственными гражданскими служащими Новосибирской области сведений о доходах, об имуществе и обязательствах имущественного характера»
  • Постановление Губернатора Новосибирской области от 26.11.2009 № 498 «О проверке достоверности и полноты сведений, представляемых гражданами, претендующими на замещение должностей государственной гражданской службы Новосибирской области, и государственными гражданскими служащими Новосибирской области, и соблюдения государственными гражданскими служащими Новосибирской области требований к служебному поведению»
  • Постановление Губернатора Новосибирской области от 21. 09.2010 № 306 «Об утверждении Положения о комиссиях по соблюдению требований к служебному поведению государственных гражданских служащих Новосибирской области и урегулированию конфликта интересов»
  • Постановление Губернатора Новосибирской области от 09.08.2010 № 237 «Об утверждении Положения о порядке оформления, выдачи и учета служебных удостоверений в исполнительных органах государственной власти Новосибирской области и в администрации Губернатора Новосибирской области и Правительства Новосибирской области»
  • Постановление Губернатора Новосибирской области от 06.12.2010 № 377 «Об утверждении Перечня должностей государственной гражданской службы областных исполнительных органов государственной власти Новосибирской области, назначение на которые осуществляется Губернатором Новосибирской области, исполнение должностных обязанностей по которым связано с использованием сведений, составляющих государственную тайну, при назначении на которые конкурс может не проводиться»
  • Постановление Правительства Новосибирской области от 04. 10.2010 № 162-п «Об утверждении Порядка и условий предоставления ежегодного дополнительного оплачиваемого отпуска государственным гражданским служащим Новосибирской области, имеющим ненормированный служебный день»
  • Постановление Губернатора Новосибирской области от 01.06.2011 № 134 «Об утверждении перечня должностей, периоды службы (работы) в которых включаются в стаж государственной гражданской службы для назначения пенсии за выслугу лет государственных гражданских служащих Новосибирской области, Положения о комиссии по рассмотрению вопросов о включении в стаж государственной гражданской службы для назначения пенсии за выслугу лет государственных гражданских служащих Новосибирской области периодов работы на отдельных должностях руководителей и специалистов в организациях при Губернаторе Новосибирской области и ее состава»
  • Постановление Губернатора Новосибирской области от 13.05.2011 № 119 «О Кодексе этики и служебного поведения государственных гражданских служащих Новосибирской области»
  • Постановление Губернатора Новосибирской области от 20.
    12.2012 № 228 «Об утверждении Положения о наставничестве в администрации Губернатора Новосибирской области и Правительства Новосибирской области, исполнительных органах государственной власти Новосибирской области»
  • Приказ администрации Губернатора Новосибирской области и Правительства Новосибирской области от 12.03.2013 № 6 «Об утверждении документов, направленных на обеспечение выполнения обязательств предусмотренных Федеральным законом от 27.07.2006 № 152-ФЗ»
  • Приказ администрации Губернатора Новосибирской области и Правительства Новосибирской области от 08.05.2013 № 13 «Об утверждении Порядка уведомления представителя нанимателя о фактах обращения в целях склонения государственного гражданского служащего к совершению коррупционных правонарушений, регистрации уведомлений и организации проверки содержащихся в них сведений в администрации Губернатора Новосибирской области и Правительства Новосибирской области»

Государственные программы развития государственной гражданской службы:
 

  • Постановление Правительства Новосибирской области от 21. 07.2014 N 285-п “Об утверждении Программы “Развитие государственной гражданской службы Новосибирской области и муниципальной службы в Новосибирской области на 2014 – 2016 годы”


Перечень нормативных правовых актов по вопросам государственной гражданской службы принимаемых государственными органами (представителем нанимателя):
 

  • Об утверждении служебного распорядка (пункт 3 статьи 56 Федерального Закона от 27.07.2004 № 79-ФЗ «О государственной гражданской службе российской Федерации»
  • О квалификационных требованиях к профессиональным знаниям и навыкам, необходимым для исполнения должностных обязанностей государственных гражданских служащих (пункт 6 статьи 12 Федерального закона от 27.07.2004 № 79-ФЗ «О государственной гражданской службе Российской Федерации»; пункт 2 статьи 6 Закона Новосибирской области от 01.02.2005 № 265-ОЗ «О государственной гражданской службе Новосибирской области»
  • Перечень должностей гражданской службы с ненормированным служебным днем (статья 45 Федерального закона от 27. 07.2004 № 79-ФЗ «О государственной гражданской службе Российской Федерации», статья з Закона Новосибирской области от 01.02.2005 № 265-ОЗ «О государственной гражданской службе Новосибирской области»; постановление Правительства новосибирской области от 04.10.2010 № 162-п «Об утверждении Порядка и условий предоставления ежегодного дополнительного оплачиваемого отпуска государственным гражданским служащим Новосибирской области, имеющим ненормированный служебный день»)
  • Перечень должностей, при назначении на которые граждане и при замещении которых государственные гражданские служащие Новосибирской области обязаны представлять сведения о своих доходах, об имуществе и обязательствах имущественного характера, а также сведения о доходах, об имуществе и обязательствах имущественного характера своих супруги (супруга) и несовершеннолетних (постановление Губернатора Новосибирской области от 03.08.2009 № 333 «О представлении гражданами, претендующими на замещение должности государственной гражданской службы Новосибирской области, и государственными гражданскими служащими Новосибирской области сведений о доходах, об имуществе и обязательствах имущественного характера»)
  • Перечень должностей государственной гражданской службы Новосибирской области в соответствии с пунктом 4 перечня должностей государственной гражданской службы Новосибирской области, при замещении которых государственные гражданские служащие Новосибирской области обязаны представлять сведения о своих расходах, а также о расходах своих супруг (супругов) и несовершеннолетних детей по каждой сделке по приобретению земельного участка, другого объекта недвижимости, транспортного средства, ценных бумаг, акций (долей участия, паев в уставных (складочных) капиталах организаций), если сумма сделки превышает общий доход данного лица и его супруги (супруга) за три последних года, предшествующих совершению сделки, и об источниках получения средств, за счет которых совершена сделка (пункт 4 постановления Губернатора Новосибирской области от 29. 05.2013 № 136 «О мерах по реализации отдельных положений Федерального закона «О контроле за соответствием расходов лиц, замещающих государственные должности, и иных лиц их доходам»)
  • Порядок выплаты материальной помощи государственным гражданским служащим (часть 8 статьи 50 Федерального закона от 27.07.2004 № 79 –ФЗ «О государственной гражданской службе Российской Федерации»», постановление Губернатора Новосибирской области от 13.07.2007 № 285 «Об утверждении Положения об оплате труда в органах государственной власти, государственных органах Новосибирской области»)
  • Порядок выплаты ежемесячной надбавки за особые условия государственной гражданской службы (часть 7 статьи 50 Федерального закона от 27.07.2004 № 79-ФЗ «О государственной гражданской службе Российской Федерации»)
  • Порядок выплаты премий за выполнение особо важных и сложных заданий государственным гражданским служащим (пункт 4 части 5 статьи 50 Федерального закона от 27.07.2004 № 79-ФЗ «О государственной гражданской службе Российской Федерации» и постановление Губернатора Новосибирской области от 13. 07.2007 № 285 «Об утверждении Положения об оплате труда в органах государственной власти, государственных органах Новосибирской области»)
  • Порядок выплаты ежемесячной надбавки за сложность, напряженность, высокие достижения в труде и специальный режим работы, премии по результатам работы и материальной помощи работникам, замещающим должности, не являющиеся должностями государственной гражданской службы (постановление Губернатора новосибирской области от 17.05.2007 № 206 «Об утверждении положения об оплате труда работников, замещающих должности, не являющиеся должностями государственной гражданской службы Новосибирской области, в органах государственной власти Новосибирской области и государственных органах Новосибирской области»)
  • Порядок работы комиссии по индивидуальным служебным спорам (часть 3 статьи 70 Федерального закона от 27.07.2004 № 79-ФЗ «О государственной гражданской службе Российской Федерации»).
  • О конкурсной комиссии по проведению конкурсов на замещение вакантной должности государственной гражданской службы сроках, порядке её работы и методике проведения конкурса (статья 22 Федерального закона от 27. 07.2004 № 79-ФЗ «О государственной гражданской службе Российской Федерации )
  • Об утверждении состава аттестационной комиссии по аттестации государственных гражданских служащих (статья 48 Федерального закона от 27.07.2004 № 79-ФЗ «О государственной гражданской службе Российской Федерации, Указ Президента Российской Федерации от 01.02.2005 № 110 «О проведении аттестации государственных гражданских служащих Российской Федерации»)
  • Положение о комиссии по соблюдению требований к служебному поведению государственных гражданских служащих и урегулированию конфликта интересов (постановление Губернатора Новосибирской области от 21.09.2010 № 306 «Об утверждении положения о комиссиях по соблюдению требований к служебному поведению государственных гражданских служащих Новосибирской области и урегулированию конфликта интересов»)
  • Порядок поступления в кадровую службу государственного органа либо специалисту кадровой службы государственного органа, ответственного за работу по профилактике коррупционных и иных правонарушений обращения гражданина, и заявление гражданского служащего предусмотренных абзацами 2 и 3 подпункта 2 пункта 15 (пункт 2 постановления Губернатора Новосибирской области от 21. 09.2010 № 306 «Об утверждении положения о комиссиях по соблюдению требований к служебному поведению государственных гражданских служащих Новосибирской области и урегулированию конфликта интересов»)
  • Порядок поступления председателю комиссии, информации, содержащей основание для проведения заседания комиссии (пункт 2 постановления Губернатора Новосибирской области от 21.09.2010 № 306 «Об утверждении положения о комиссиях по соблюдению требований к служебному поведению государственных гражданских служащих Новосибирской области и урегулированию конфликта интересов»)
  • Порядок уведомления представителя нанимателя о фактах обращения в целях склонения государственного гражданского служащего к совершению коррупционных правонарушений.(часть 5 статьи 9 Федерального закона от 25.12.2008 № 273-ФЗ «О противодействии коррупции»)
  • Об утверждении составов аттестационных комиссий по аттестации государственных гражданских служащих (статья 48 Федерального закона от 27.07. 2004 № 79-ФЗ «О государственной гражданской службе Российской Федерации», Указ Президента Российской Федерации от 01.02.2005 № 110 «О проведении аттестации государственных гражданских служащих Российской Федерации»)
  • Документы по обеспечению выполнения обязанностей, предусмотренных Федеральным законом от 27.07.2006 № 152- ФЗ « О персональных данных» и во исполнение Постановления Правительства РФ от 21.03.2012 № 211 «Об утверждении перечня мер, направленных на обеспечение выполнения обязанностей, предусмотренных Федеральным законом «О персональных данных» и принятыми в соответствии с ним нормативными правовыми актами, операторами, являющимися государственными или муниципальными органами»

Федеральный закон от 27.07.2004 № 79-ФЗ “О государственной гражданской службе Российской Федерации”

Принят
Государственной Думой
7 июля 2004 года

Одобрен
Советом Федерации
15 июля 2004 года

(в ред. Федеральных законов от 02. 02.2006 № 19-ФЗ, от 02.03.2007 № 24-ФЗ, от 12.04.2007 № 48-ФЗ, от 01.12.2007 № 309-ФЗ, от 29.03.2008 № 30-ФЗ, от 23.07.2008 № 160-ФЗ, от 25.12.2008 № 280-ФЗ, от 17.07.2009 № 160-ФЗ, от 18.07.2009 № 187-ФЗ, от 25.11.2009 № 269-ФЗ, от 17.12.2009 № 322-ФЗ, от 29.01.2010 № 1-ФЗ, от 14.02.2010 № 9-ФЗ, от 29.11.2010 № 317-ФЗ, от 28.12.2010 № 419-ФЗ, от 27.06.2011 № 155-ФЗ, от 11.07.2011 № 204-ФЗ, от 21.11.2011 № 329-ФЗ, от 06.12.2011 № 395-ФЗ, от 03.12.2012 № 231-ФЗ, от 30.12.2012 № 295-ФЗ, от 30.12.2012 № 327-ФЗ, от 05.04.2013 № 57-ФЗ, от 07.05.2013 № 99-ФЗ, от 07.05.2013 № 102-ФЗ, от 07.06.2013 № 116-ФЗ, от 02.07.2013 № 149-ФЗ, от 02.07.2013 № 170-ФЗ, от 02.07.2013 № 185-ФЗ, от 22.10.2013 № 284-ФЗ, от 25.11.2013 № 317-ФЗ, от 28.12.2013 № 396-ФЗ, от 02.04.2014 № 53-ФЗ, от 22.12.2014 № 431-ФЗ, от 31.12.2014 № 509-ФЗ, от 31.12.2014 № 510-ФЗ, от 08.06.2015 № 147-ФЗ, от 13.07.2015 № 262-ФЗ, от 05.10.2015 № 285-ФЗ, от 29.12.2015 № 395-ФЗ, от 30.12.2015 № 418-ФЗ, от 02.06.2016 № 176-ФЗ, от 30.06.2016 № 224-ФЗ, от 03. 07.2016 № 276-ФЗ, от 28.12.2016 № 505-ФЗ, от 03.04.2017 № 64-ФЗ, от 01.07.2017 № 133-ФЗ, от 26.07.2017 № 192-ФЗ, от 29.07.2017 № 275-ФЗ, от 28.12.2017 № 423-ФЗ, с изм., внесенными федеральными законами от 17.12.2009 № 313-фз, от 13.12.2010 № 358-фз, постановлениями конституционного суда рф от 22.11.2011 № 25-п, от 15.11.2012 № 26-п, от 06.12.2012 № 31-п, федеральными законами от 02.12.2013 № 350-фз, от 01.12.2014 № 396-фз, от 06.04.2015 № 68-фз (ред. 19.12.2016))

1. В связи с прохождением гражданской службы гражданскому служащему запрещается:
[…]
9) разглашать или использовать в целях, не связанных с гражданской службой, сведения, отнесенные в соответствии с федеральным законом к сведениям конфиденциального характера, или служебную информацию, ставшие ему известными в связи с исполнением должностных обязанностей;
[…]
3. Гражданин после увольнения с гражданской службы не вправе разглашать или использовать в интересах организаций либо физических лиц сведения конфиденциального характера или служебную информацию, ставшие ему известными в связи с исполнением должностных обязанностей.
[…]

[…]
3. Сведения о доходах, об имуществе и обязательствах имущественного характера, представляемые гражданским служащим в соответствии с настоящей статьей, являются сведениями конфиденциального характера, если федеральным законом они не отнесены к сведениям, составляющим государственную тайну.
[…]

1. Поступление гражданина на гражданскую службу для замещения должности гражданской службы или замещение гражданским служащим другой должности гражданской службы осуществляется по результатам конкурса, если иное не установлено настоящей статьей. Конкурс заключается в оценке профессионального уровня претендентов на замещение должности гражданской службы, их соответствия установленным квалификационным требованиям к должности гражданской службы.

2. Конкурс не проводится:
1) при назначении на замещаемые на определенный срок полномочий должности гражданской службы категорий «руководители» и «помощники (советники)»;
2) при назначении на должности гражданской службы категории «руководители», назначение на которые и освобождение от которых осуществляются Президентом Российской Федерации или Правительством Российской Федерации;
3) при заключении срочного служебного контракта;
4) при назначении гражданского служащего на иную должность гражданской службы в случаях, предусмотренных частью 2 статьи 28 и частями 1, 2 и 3 статьи 31 настоящего Федерального закона;
5) при назначении на должность гражданской службы гражданского служащего (гражданина), состоящего в кадровом резерве, сформированном на конкурсной основе.

3. Конкурс может не проводиться при назначении на отдельные должности гражданской службы, исполнение должностных обязанностей по которым связано с использованием сведений, составляющих государственную тайну, по перечню должностей, утверждаемому нормативным актом государственного органа.

4. По решению представителя нанимателя конкурс может не проводиться при назначении на должности гражданской службы, относящиеся к группе младших должностей гражданской службы.

5. Претенденту на замещение должности гражданской службы может быть отказано в допуске к участию в конкурсе в связи с несоответствием квалификационным требованиям к вакантной должности гражданской службы, а также в связи с ограничениями, установленными настоящим Федеральным законом для поступления на гражданскую службу и ее прохождения.

6. Претендент на замещение должности гражданской службы, не допущенный к участию в конкурсе, вправе обжаловать это решение в соответствии с настоящим Федеральным законом.

7. Для проведения конкурса на замещение вакантной должности гражданской службы правовым актом соответствующего государственного органа образуется конкурсная комиссия.

8. 8. В состав конкурсной комиссии входят представитель нанимателя и (или) уполномоченные им гражданские служащие (в том числе из подразделения по вопросам государственной службы и кадров, юридического (правового) подразделения и подразделения, в котором проводится конкурс на замещение вакантной должности гражданской службы), представитель соответствующего органа по управлению государственной службой, а также представители научных и образовательных организаций, других организаций, приглашаемые органом по управлению государственной службой по запросу представителя нанимателя в качестве независимых экспертов – специалистов по вопросам, связанным с гражданской службой, без указания персональных данных экспертов. Число независимых экспертов должно составлять не менее одной четверти от общего числа членов конкурсной комиссии.

9. Состав конкурсной комиссии для проведения конкурса на замещение вакантной должности гражданской службы, исполнение должностных обязанностей по которой связано с использованием сведений, составляющих государственную тайну, формируется с учетом положений законодательства Российской Федерации о государственной тайне.

10. Состав конкурсной комиссии формируется таким образом, чтобы была исключена возможность возникновения конфликтов интересов, которые могли бы повлиять на принимаемые конкурсной комиссией решения.

11. Претендент на замещение должности гражданской службы вправе обжаловать решение конкурсной комиссии в соответствии с настоящим Федеральным законом.

12. Положение о конкурсе на замещение вакантной должности государственной гражданской службы Российской Федерации, определяющее порядок и условия его проведения, утверждается указом Президента Российской Федерации.

[…]
4. В служебном контракте могут предусматриваться следующие условия:
1) испытание, которое устанавливается в соответствии со статьей 27 настоящего Федерального закона;
2) неразглашение сведений, составляющих государственную и иную охраняемую федеральным законом тайну, и служебной информации, если должностным регламентом предусмотрено использование таких сведений;
3) обязанность лица проходить гражданскую службу после окончания обучения в профессиональной образовательной организации или образовательной организации высшего образования не менее установленного договором о целевом приеме или договором о целевом обучении срока, если обучение осуществлялось за счет средств соответствующего бюджета;
4) показатели результативности профессиональной служебной деятельности гражданского служащего и связанные с ними условия оплаты его труда;
5) иные условия, не ухудшающие положения гражданского служащего по сравнению с положением, установленным настоящим Федеральным законом, другими законами и иными нормативными правовыми актами.
[…]

1. Служебный контракт может быть расторгнут представителем нанимателя, а гражданский служащий освобожден от замещаемой должности гражданской службы и уволен с гражданской службы в случае:
[…]
3) однократного грубого нарушения гражданским служащим должностных обязанностей:
[…]
в) разглашения сведений, составляющих государственную и иную охраняемую федеральным законом тайну, и служебной информации, ставших известными гражданскому служащему в связи с исполнением им должностных обязанностей;
[…]
8) прекращения допуска гражданского служащего к сведениям, составляющим государственную тайну, если исполнение должностных обязанностей требует допуска к таким сведениям;
[…]

1. При обработке персональных данных гражданского служащего кадровая служба государственного органа обязана соблюдать следующие требования:
1) обработка персональных данных гражданского служащего осуществляется в целях обеспечения соблюдения Конституции Российской Федерации, настоящего Федерального закона, законодательства Российской Федерации в области персональных данных, других федеральных законов и иных нормативных правовых актов Российской Федерации, содействия гражданскому служащему в прохождении гражданской службы, обучении и должностном росте, обеспечения личной безопасности гражданского служащего и членов его семьи, а также в целях обеспечения сохранности принадлежащего ему имущества, учета результатов исполнения им должностных обязанностей и обеспечения сохранности имущества государственного органа;
2) персональные данные следует получать лично у гражданского служащего. В случае возникновения необходимости получения персональных данных гражданского служащего у третьей стороны следует известить об этом гражданского служащего заранее, получить его письменное согласие и сообщить гражданскому служащему о целях, предполагаемых источниках и способах получения персональных данных;
3) запрещается обрабатывать и приобщать к личному делу гражданского служащего не установленные настоящим Федеральным законом и другими федеральными законами персональные данные о его политических, религиозных и иных убеждениях и частной жизни, о членстве в общественных объединениях, в том числе в профессиональных союзах;
4) при принятии решений, затрагивающих интересы гражданского служащего, запрещается основываться на персональных данных гражданского служащего, полученных исключительно в результате их автоматизированной обработки;
5) защита персональных данных гражданского служащего от неправомерного их использования или утраты обеспечивается за счет средств государственного органа в порядке, установленном настоящим Федеральным законом и другими федеральными законами;
6) передача персональных данных гражданского служащего третьей стороне не допускается без письменного согласия гражданского служащего, за исключением случаев, установленных законодательством Российской Федерации в области персональных данных. Условия передачи персональных данных гражданского служащего третьей стороне устанавливаются нормативными правовыми актами Российской Федерации.

2. Гражданский служащий, виновный в нарушении норм, регулирующих обработку персональных данных другого гражданского служащего, несет ответственность в соответствии с настоящим Федеральным законом и другими федеральными законами.

3. В личное дело гражданского служащего вносятся его персональные данные и иные сведения, связанные с поступлением на гражданскую службу, ее прохождением и увольнением с гражданской службы и необходимые для обеспечения деятельности государственного органа.

4. Положение о персональных данных государственного гражданского служащего Российской Федерации и ведении его личного дела утверждается Президентом Российской Федерации.

1. Представителем нанимателя ведется реестр гражданских служащих.

2. Сведения из личного дела гражданского служащего включаются в реестр гражданских служащих в государственном органе и хранятся на электронных носителях с обеспечением защиты от несанкционированного доступа и копирования.

3. Умерший (погибший) гражданский служащий, а также гражданский служащий, признанный безвестно отсутствующим или объявленный умершим решением суда, вступившим в законную силу, исключается из реестра гражданских служащих в день, следующий за днем смерти (гибели) гражданского служащего или днем вступления в законную силу решения суда.

4 – 5. Утратили силу. – Федеральный закон от 28.12.2010 № 419-ФЗ.

[…]
11. Состав аттестационной комиссии для проведения аттестации гражданских служащих, замещающих должности гражданской службы, исполнение должностных обязанностей по которым связано с использованием сведений, составляющих государственную тайну, формируется с учетом положений законодательства Российской Федерации о государственной тайне.
[…]

[…]
8. Гражданский служащий, в отношении которого проводится служебная проверка, имеет право:
1) давать устные или письменные объяснения, представлять заявления, ходатайства и иные документы;
2) обжаловать решения и действия (бездействие) гражданских служащих, проводящих служебную проверку, представителю нанимателя, назначившему служебную проверку;
3) ознакомиться по окончании служебной проверки с письменным заключением и другими материалами по результатам служебной проверки, если это не противоречит требованиям неразглашения сведений, составляющих государственную и иную охраняемую федеральным законом тайну.
[…]

Статья 47 [ФЗ от 27.07.2004 N 79-ФЗ] – последняя редакция

Статья 47. Должностной регламент

1. Профессиональная служебная деятельность гражданского служащего осуществляется в соответствии с должностным регламентом, утверждаемым представителем нанимателя и являющимся составной частью административного регламента государственного органа.

2. В должностной регламент включаются:

1) квалификационные требования для замещения должности гражданской службы;

2) должностные обязанности, права и ответственность гражданского служащего за неисполнение (ненадлежащее исполнение) должностных обязанностей в соответствии с административным регламентом государственного органа, задачами и функциями структурного подразделения государственного органа и функциональными особенностями замещаемой в нем должности гражданской службы;

3) перечень вопросов, по которым гражданский служащий вправе или обязан самостоятельно принимать управленческие и иные решения;

4) перечень вопросов, по которым гражданский служащий вправе или обязан участвовать при подготовке проектов нормативных правовых актов и (или) проектов управленческих и иных решений;

5) сроки и процедуры подготовки, рассмотрения проектов управленческих и иных решений, порядок согласования и принятия данных решений;

6) порядок служебного взаимодействия гражданского служащего в связи с исполнением им должностных обязанностей с гражданскими служащими того же государственного органа, гражданскими служащими иных государственных органов, другими гражданами, а также с организациями;

7) перечень государственных услуг, оказываемых гражданам и организациям в соответствии с административным регламентом государственного органа;

8) показатели эффективности и результативности профессиональной служебной деятельности гражданского служащего.

3. Положения должностного регламента учитываются при проведении конкурса на замещение вакантной должности гражданской службы, аттестации, квалификационного экзамена, планировании профессиональной служебной деятельности гражданского служащего.

4. Результаты исполнения гражданским служащим должностного регламента учитываются при проведении конкурса на замещение вакантной должности гражданской службы или включении гражданского служащего в кадровый резерв, оценке его профессиональной служебной деятельности при проведении аттестации, квалификационного экзамена либо поощрении гражданского служащего.

5. Примерные должностные регламенты утверждаются соответствующим органом по управлению государственной службой.

Меры юридической ответственности – Официальный сайт Администрации Санкт‑Петербурга

Нормы статей Федерального закона «О государственной гражданской службе Российской Федерации» от 27.07.2014 № 79-ФЗ

Статья 59. 1. Взыскания за несоблюдение ограничений и запретов, требований о предотвращении или об урегулировании конфликта интересов и неисполнение обязанностей, установленных в целях противодействия коррупции
За несоблюдение гражданским служащим ограничений и запретов, требований о предотвращении или об урегулировании конфликта интересов и неисполнение обязанностей, установленных в целях противодействия коррупции настоящим Федеральным законом, Федеральным законом от 25 декабря 2008 года 273-ФЗ “О противодействии коррупции” и другими федеральными законами, налагаются следующие взыскания:

  1. замечание;

  2. выговор;

  3. предупреждение о неполном должностном соответствии.

Статья 59.2. Увольнение в связи с утратой доверия

  1. Гражданский служащий подлежит увольнению в связи с утратой доверия в случае:
    1) непринятия гражданским служащим мер по предотвращению и (или) урегулированию конфликта интересов, стороной которого он является;
    КонсультантПлюс: примечание.
    О выявлении конституционно-правового смысла п. 2 ч. 1 ст. 59.2 см. Постановление КС РФ от 06.04.2020 N 14-П.
    2) непредставления гражданским служащим сведений о своих доходах, расходах, об имуществе и обязательствах имущественного характера, а также о доходах, расходах, об имуществе и обязательствах имущественного характера своих супруги (супруга) и несовершеннолетних детей либо представления заведомо недостоверных или неполных сведений;
    3) участия гражданского служащего на платной основе в деятельности органа управления коммерческой организацией, за исключением случаев, установленных федеральным законом;
    4) осуществления гражданским служащим предпринимательской деятельности;
    5) вхождения гражданского служащего в состав органов управления, попечительских или наблюдательных советов, иных органов иностранных некоммерческих неправительственных организаций и действующих на территории Российской Федерации их структурных подразделений, если иное не предусмотрено международным договором Российской Федерации или законодательством Российской Федерации;
    6) нарушения гражданским служащим, его супругой (супругом) и несовершеннолетними детьми запрета открывать и иметь счета (вклады), хранить наличные денежные средства и ценности в иностранных банках, расположенных за пределами территории Российской Федерации, владеть и (или) пользоваться иностранными финансовыми инструментами.
  2. Представитель нанимателя, которому стало известно о возникновении у гражданского служащего личной заинтересованности, которая приводит или может привести к конфликту интересов, подлежит увольнению в связи с утратой доверия также в случае непринятия представителем нанимателя мер по предотвращению и (или) урегулированию конфликта интересов, стороной которого является подчиненный ему гражданский служащий.
  3. Сведения о применении к гражданскому служащему взыскания в виде увольнения в связи с утратой доверия за совершение коррупционного правонарушения включаются государственным органом, в котором гражданский служащий проходил гражданскую службу, в реестр лиц, уволенных в связи с утратой доверия, предусмотренный статьей 15 Федерального закона от 25 декабря 2008 года N 273-ФЗ “О противодействии коррупции”.

Статья 59.3. Порядок применения взысканий за коррупционные правонарушения

  1. Взыскания, предусмотренные статьями 59. 1 и 59.2 настоящего Федерального закона, применяются представителем нанимателя на основании доклада о результатах проверки, проведенной подразделением кадровой службы соответствующего государственного органа по профилактике коррупционных и иных правонарушений, а в случае, если доклад о результатах проверки направлялся в комиссию по урегулированию конфликтов интересов, – и на основании рекомендации указанной комиссии. С согласия гражданского служащего и при условии признания им факта совершения коррупционного правонарушения взыскание, за исключением увольнения в связи с утратой доверия, может быть применено на основании доклада подразделения кадровой службы соответствующего государственного органа по профилактике коррупционных и иных правонарушений о совершении коррупционного правонарушения, в котором излагаются фактические обстоятельства его совершения, и письменного объяснения такого гражданского служащего.
  2. При применении взысканий, предусмотренных статьями 59.1 и 59.2 настоящего Федерального закона, учитываются характер совершенного гражданским служащим коррупционного правонарушения, его тяжесть, обстоятельства, при которых оно совершено, соблюдение гражданским служащим других ограничений и запретов, требований о предотвращении или об урегулировании конфликта интересов и исполнение им обязанностей, установленных в целях противодействия коррупции, а также предшествующие результаты исполнения гражданским служащим своих должностных обязанностей.
  3.  Взыскания, предусмотренные статьями 59.1 и 59.2 настоящего Федерального закона, применяются не позднее шести месяцев со дня поступления информации о совершении гражданским служащим коррупционного правонарушения, не считая периодов временной нетрудоспособности гражданского служащего, пребывания его в отпуске, других случаев отсутствия его на службе по уважительным причинам, и не позднее трех лет со дня совершения им коррупционного правонарушения. В указанные сроки не включается время производства по уголовному делу.
    3.1.  Взыскание в виде замечания может быть применено к гражданскому служащему при малозначительности совершенного им коррупционного правонарушения.
  4. В акте о применении к гражданскому служащему взыскания в случае совершения им коррупционного правонарушения в качестве основания применения взыскания указывается статья 59.1 или 59.2 настоящего Федерального закона.
  5. Копия акта о применении к гражданскому служащему взыскания с указанием коррупционного правонарушения и нормативных правовых актов, положения которых им нарушены, или об отказе в применении к гражданскому служащему такого взыскания с указанием мотивов вручается гражданскому служащему под расписку в течение пяти дней со дня издания соответствующего акта.
  6.  Гражданский служащий вправе обжаловать взыскание в письменной форме в комиссию государственного органа по служебным спорам или в суд.
  7.  Если в течение одного года со дня применения взыскания гражданский служащий не был подвергнут дисциплинарному взысканию, предусмотренному пунктом 1, 2 или 3 части 1 статьи 57 настоящего Федерального закона, или взысканию, предусмотренному пунктом 1, 2 или 3 статьи 59.1 настоящего Федерального закона, он считается не имеющим взыскания.

Реестр лиц, уволенных в связи с утратой доверия

Согласно пункту 3 статьи 59.2 Федерального закона “О государственной гражданской службе Российской Федерации” с 01.01.2018 сведения о применении к гражданскому служащему взыскания в виде увольнения в связи с утратой доверия за совершение коррупционного правонарушения включаются государственным органом, в котором гражданский служащий проходил гражданскую службу, в реестр лиц, уволенных в связи с утратой доверия, предусмотренный в статье 15 Федерального закона “О противодействии коррупции”.

Количество гражданских служащих, к которым применены меры юридической (дисциплинарной) ответственности за совершение коррупционных правонарушений с указанием даты совершения коррупционного проступка, вида коррупционного правонарушения, категории должности гражданской службы, замещаемой гражданским служащим

В II полугодии 2020 года к гражданским служащим Комитета по тарифам Санкт‑Петербурга не применялись меры юридической (дисциплинарной) ответственности за совершение коррупционных правонарушений.

В I полугодии 2020 года к гражданским служащим Комитета по тарифам Санкт‑Петербурга не применялись меры юридической (дисциплинарной) ответственности за совершение коррупционных правонарушений.

В II полугодии 2019 года к гражданским служащим Комитета по тарифам Санкт‑Петербурга не применялись меры юридической (дисциплинарной) ответственности за совершение коррупционных правонарушений.

В I полугодии 2019 года к гражданским служащим Комитета по тарифам Санкт‑Петербурга не применялись меры юридической (дисциплинарной) ответственности за совершение коррупционных правонарушений.

В третьем квартале 2018 года к гражданскому служащему Комитета по тарифам Санкт‑Петербурга применено взыскание в виде замечание за несоблюдение обязанности, установленной в целях противодействия коррупции Федеральным законом от 27.07.2004 № 79-ФЗ «О государственной гражданской службе Российской Федерации», Федеральным законом от 25.12.2008 года № 273-ФЗ «О противодействии коррупции», а именно за представление недостоверных и неполных сведений в отношении супруга в соответствии с Законом Санкт‑Петербурга от 11.05.2016 № 248-44 (приказ Комитета по тарифам Санкт‑Петербурга от 15.08.2018 № 302-к) .

В I полугодии 2018 года к гражданским служащим Комитета по тарифам Санкт‑Петербурга не применялись меры юридической (дисциплинарной) ответственности за совершение коррупционных правонарушений.

ФСБ завершила расследование дела Сафронова :: Общество :: РБК

Иван Сафронов был задержан в июле 2020 года и с тех пор находится под стражей. В октябре ему в очередной раз ужесточили условия содержания — запретили вести переписку

Иван Сафронов (Фото: Валерий Шарифулин / ТАСС)

Следователи ФСБ завершили расследование уголовного дела советника главы «Роскосмоса» Ивана Сафронова, обвиняемого в государственной измене, защита начала знакомиться с материалами, сообщил источник ТАСС в правоохранительных органах.

«В настоящий момент следственные действия по делу Сафронова завершены. Материалы дела переданы защите и самому обвиняемому для ознакомления. После этого дело поступит в прокуратуру на утверждение», — сказал собеседник агентства. Об этом же сообщил источник «РИА Новости».

Адвокат Сафронова Дмитрий Талантов заявил, что начал ознакомление с делом. «Я могу сказать только, что в настоящее время начал знакомиться с материалами дела», — отметил он.

Защита Сафронова заявила об ужесточении условий в СИЗО после статьи

Сафронова задержали утром 7 июля по обвинению по ст. 275 УК (государственная измена, предусматривает от 12 до 20 лет лишения свободы). Лефортовский суд отправил его под арест. Срок содержания под стражей несколько раз продлевали, заседания проходили в закрытом режиме. Сафронов не признал вину и связывает происходящее со своей профессиональной журналистской деятельностью: до прихода в «Роскосмос» он работал в газете «Коммерсантъ» и других изданиях.

26 Кодекс США § 48 – Энергетический кредит | Кодекс США | Поправки к Закону США

2020 — Подсек. (а) (2) (А) (i) (II). Паб. L. 116–260, §132 (a) (1) (A), заменено «1 января 2024 года» на «1 января 2022 года».

Подсек. (а) (2) (А) (i) (V). Паб. L. 116–260, §203 (b), добавлен подпункт. (V).

Подсек. (а) (3) (А) (ii), (vii). Паб. L. 116–260, §132 (a) (1) (B), заменено «1 января 2024 года» на «1 января 2022 года».

Подсек. (а) (3) (А) (viii). Паб. L. 116–260, §203 (a), добавлен п. (viii).

Подсек.(а) (5) (С) (ii). Паб. L. 116–260, §131 (b), заменено «1 января 2022 года» на «1 января 2021 года».

Подсек. (а) (5) (Е) (iv). Паб. L. 116–260, §131 (c) (2), заменено «1 января 2022 года» на «1 января 2021 года».

Подсек. (а) (5) (F). Паб. L. 116–260, §204 (a), добавлен подпункт. (F).

Подсек. (а) (6) (А). Паб. L. 116–260, §132 (b) (1) (A) (i), во вводных положениях заменено «1 января 2024 года, процент энергии» на «1 января 2022 года, процент энергии».

Подсек.(а) (6) (А) (i). Паб. L. 116–260, §132 (b) (1) (A) (ii), заменено «1 января 2023 года» на «1 января 2021 года».

Подсек. (а) (6) (А) (ii). Паб. L. 116–260, §132 (b) (1) (A) (iii), заменено «после 31 декабря 2022 г. и до 1 января 2024 г.» на «после 31 декабря 2020 г. и до 1 января 2022 г. ».

Подсек. (а) (6) (В). Паб. L. 116–260, §132 (b) (1) (B), замененный «начинается до 1 января 2024 г. и не вводится в эксплуатацию до 1 января 2026 г.» на «начинается до 1 января 2022 г. и который не будет введен в эксплуатацию до 1 января 2024 года ».

Подсек. (а) (7). Паб. L. 116–260, §203 (c) (2), в заголовке заменено «определенное другое» на «оптоволоконный солнечный, квалифицированный топливный элемент и квалифицированный малый ветер».

Подсек. (а) (7) (А). Паб. L. 116–260, §203 (c) (1), во вводных положениях добавлено «свойство рекуперации энергии из отходов» после «квалифицированного небольшого ветряного имущества».

Подсек. (а) (7) (А) (i). Паб. L. 116–260, §132 (b) (2) (A) (i), заменено «1 января 2023 года» на «1 января 2021 года».

Подсек. (а) (7) (А) (ii).Паб. L. 116–260, §132 (b) (2) (A) (ii), заменено «после 31 декабря 2022 г. и до 1 января 2024 г.» на «после 31 декабря 2020 г. и до 1 января 2022 г. ».

Подсек. (а) (7) (В). Паб. L. 116–260, §132 (b) (2) (B), заменено «1 января 2026 года» на «1 января 2024 года».

Подсек. (c) (1) (D), (2) (D), (3) (A) (iv), (4) (C). Паб. L. 116–260, §132 (a) (2), заменено «1 января 2024 года» на «1 января 2022 года».

Подсек. (в) (5). Паб. L. 116–260, §203 (d), добавлен п. (5).

2019 — Subsec.(а) (5) (С) (ii). Паб. L. 116–94, §127 (b), заменено «1 января 2021 г.» на «1 января 2018 г. (1 января 2020 г., в случае любого учреждения, описанного в параграфе (1) статьи 45 (d )) ».

Подсек. (а) (5) (Е) (iv). Паб. L. 116–94, §127 (c) (2) (B), добавлен п. (iv).

2018 — Подст. (а) (1). Паб. L. 115–141, §401 (a) (20), заменены «и (3) (B)» на «(3) (B) и (4) (B)».

Подсек. (а) (2) (А). Паб. L. 115–123, §40411 (b) (2), во вводных положениях «параграфы (6) и (7)» заменены «параграфами (6)».

Подсек. (а) (3) (А) (ii), (vii). Паб. L. 115–123, §40411 (a), заменил «имущество, строительство которого начинается до 1 января 2022 года» на «периоды, заканчивающиеся до 1 января 2017 года».

Подсек. (а) (5) (С) (ii). Паб. L. 115–141, §401 (a) (350) (A), внесены технические поправки в язык справочника Pub. Л. 114–113, §302 (а). См. Примечание о поправках 2015 г. ниже.

Паб. L. 115–123, §40409 (b), заменено «1 января 2018 г.» на «1 января 2017 г.».

Подсек. (а) (5) (Е).Паб. L. 115–141, §401 (a) (350) (B), внесены технические поправки в язык справочника Pub. L. 114–113, §302 (b). См. Примечание о поправках 2015 г. ниже.

Паб. L. 115–123, §40411 (b) (3), во вводных положениях добавлено «которое рассматривается как энергетическая собственность на основании этого параграфа» после «использование ветра для производства электроэнергии».

Подсек. (а) (6) (В). Паб. L. 115–141, §401 (a) (21), «свойство энергии» заменено на «свойство энергии».

Подсек. (а) (7). Паб. L. 115–123, §40411 (b) (1), добавлен п.(7).

Подсек. (c) (1) (D). Паб. L. 115–123, §40411 (c), заменив «строительство которого не начинается до 1 января 2022 г.» на «на любой период после 31 декабря 2016 г.».

Подсек. (c) (2) (B). Паб. L. 115–141, §401 (a) (22), заменено «равно 200 долларам» на «равно 200 долларам».

Подсек. (c) (2) (D). Паб. L. 115–123, §40411 (d), заменено «строительство которого не начинается до 1 января 2022 г.» на «на любой период после 31 декабря 2016 г.».

Подсек.(c) (3) (A) (iv). Паб. L. 115–123, §40411 (e), заменено «строительство которого начинается до 1 января 2022 г.» на «которое введено в эксплуатацию до 1 января 2017 г. ».

Подсек. (c) (4) (C). Паб. L. 115–123, §40411 (f), заменив «строительство которого не начинается до 1 января 2022 г.» на «на любой период после 31 декабря 2016 г.».

Подсек. (г) (3). Паб. L. 115–141, §401 (a) (23) (A), вычеркнуто «должен» после «разрешить» во вводных положениях.

Подсек.(г) (3) (А). Паб. L. 115–141, §401 (a) (23) (B), вставлено «должен» перед «не».

2015 — п. (а) (2) (А). Паб. L. 114–113, §303 (c), заменено «За исключением случаев, предусмотренных в параграфе (6), процент энергии» на «Процент энергии» во вводных положениях.

Подсек. (а) (2) (А) (i) (II). Паб. L. 114–113, §303 (a), заменил «имущество, строительство которого начинается до 1 января 2022 года» на «периоды, заканчивающиеся до 1 января 2017 года».

Подсек. (а) (5) (С) (ii). Паб.L. 114–113, §187 (b), заменено «1 января 2017 г.» на «1 января 2015 г.».

Паб. L. 114–113, §302 (a), с поправками, внесенными Pub. L. 115–141, §401 (a) (350) (A), добавлено «(1 января 2020 г. , в случае любого объекта, описанного в параграфе (1) раздела 45 (d))» перед « , а также”.

Подсек. (а) (5) (Е). Паб. L. 114–113, §302 (b), с поправками, внесенными Pub. L. 115–141, §401 (a) (350) (B), добавлен подпункт. (E).

Подсек. (а) (6). Паб. L. 114–113, §303 (b), добавлен п. (6).

2014 – п.(а) (5) (С) (ii). Паб. L. 113–295, §155 (b), заменено «1 января 2015 г.» на «1 января 2014 г.».

Подсек. (г) (3) (А). Паб. L. 113–295, §209 (d), после слов «включаемый в валовой доход» добавлено «или альтернативный минимальный налогооблагаемый доход».

2013 – п. (а) (5) (В). Паб. L. 112–240, §407 (b), подпункт с поправками (C) в общем. До внесения поправок текст читался следующим образом: «Для целей данного пункта термин« квалифицированная инвестиционная кредитная линия »означает любую из следующих возможностей, если в соответствии с разделом 45 в отношении такой возможности не был предоставлен кредит и налогоплательщик делает безотзывную решение о применении данного параграфа к такому объекту:

«(i) Ветровые установки. —Любой квалифицированный объект (в значении раздела 45), описанный в пункте (1) раздела 45 (d), если такой объект введен в эксплуатацию в 2009, 2010, 2011 или 2012 году.

«(ii) Прочие объекты. – Любые квалифицированные объекты (в значении раздела 45), описанные в пунктах (2), (3), (4), (6), (7), (9) или (11) ) раздела 45 (d), если такой объект будет введен в эксплуатацию в 2009, 2010, 2011, 2012 или 2013 годах ».

Подсек. (a) (5) (D) (iii), (iv). Паб. L. 112–240, §407 (c) (1), добавлены пп.(iii) и (iv).

2009 – п. (а) (4) (D). Паб. L. 111–5, §1103 (b) (1), добавлен подпункт. (D).

Подсек. (а) (5). Паб. L. 111–5, §1102 (a), добавлен п. (5).

Подсек. (c) (4) (B) – (D). Паб. L. 111–5, §1103 (a), подпункты переименованы. (C) и (D) как (B) и (C), соответственно, и вычеркнуты бывшие подпар. (В). Текст бывшего подп. (B) гласит следующее: «В случае использования квалифицированной малой ветроэнергетической собственности, введенной в эксплуатацию в течение налогового года, кредит, определенный в соответствии с подразделом (а) (1) за такой год в отношении всего такого имущества налогоплательщика, должен не превышает 4000 долларов. ”

Подсек. (г). Паб. L. 111–5, §1104, добавлен подст. (г).

2008 — Подст. (а) (1). Паб. L. 110–343, §104 (d), заменены «параграфы (1) (B), (2) (B), (3) (B) и (4) (B)» на «параграфы (1) (B), (2) (B) и (3) (B) ».

Паб. L. 110–343, §103 (c) (3), заменены «параграфы (1) (B), (2) (B) и (3) (B)» на «параграфы (1) (B) и (2) (B) ».

Подсек. (а) (2) (А) (i) (II). Паб. L. 110–343, §103 (a) (1), заменено «1 января 2017 г.» на «1 января 2009 г.».

Подсек.(а) (2) (А) (i) (IV). Паб. L. 110–343, §104 (b), добавлен подпункт. (IV).

Подсек. (а) (3). Паб. L. 110–343, §103 (e) (1), в заключительных положениях вычеркнуты «Термин« энергетическая собственность »не должен включать какую-либо собственность, которая является общественно полезной собственностью (как определено в статье 46 (f) (5)). действует за день до даты вступления в силу Закона о согласовании доходов от 1990 г.) ». перед «Такой срок».

Подсек. (а) (3) (А) (ii). Паб. L. 110–343, §103 (a) (1), заменено «1 января 2017 г. » на «1 января 2009 г.».

Подсек. (а) (3) (А) (v). Паб. L. 110–343, §103 (c) (1), добавлен п. (v).

Подсек. (а) (3) (А) (vi). Паб. L. 110–343, §104 (a), добавлен п. (vi).

Подсек. (а) (3) (А) (vii). Паб. L. 110–343, §105 (a), добавлен п. (vii).

Подсек. (c). Паб. L. 110–343, §103 (c) (2) (A), добавлен заголовок и вычеркнут прежний заголовок «Квалифицированное свойство топливных элементов; квалифицированное микротурбинное свойство ».

Подсек. (c) (1) (B). Паб. L. 110–343, §103 (d), заменено «1500 долларов» на «500 долларов».

Подсек. (c) (1) (D). Паб. L. 110–343, §103 (e) (2) (A), переименован в подпункт. (E) как (D) и вычеркнутый заголовок и текст бывшего подпункта. (D). Текст гласит: «Первое предложение вопроса в подпункте (а) (3), которое следует за подпунктом (D), не должно применяться к квалифицированному имуществу топливных элементов, которое используется преимущественно в торговле или бизнесе, связанном с предоставлением или продажей телефонная связь, телеграфная связь посредством внутренних телеграфных операций или другие телеграфные услуги (кроме международных телеграфных услуг). ”

Подсек. (c) (1) (E). Паб. L. 110–343, §103 (e) (2) (A), переименован в подпункт. (E) как (D).

Паб. L. 110–343, §103 (a) (2), заменено «31 декабря 2016 г.» на «31 декабря 2008 г.».

Подсек. (c) (2) (D). Паб. L. 110–343, §103 (e) (2) (B), переименован в подпункт. (E) как (D) и вычеркнутый заголовок и текст бывшего подпункта. (D). Текст гласит: «Первое предложение вопроса в подпункте (а) (3), которое следует за подпунктом (D), не применяется к квалифицированной микротурбинной собственности, которая используется преимущественно в торговле или бизнесе, связанном с предоставлением или продажей телефонов. услуги, телеграфные услуги посредством внутренних телеграфных операций или другие телеграфные услуги (кроме международных телеграфных услуг).”

Подсек. (c) (2) (E). Паб. L. 110–343, §103 (e) (2) (B), переименован в подпункт. (E) как (D).

Паб. L. 110–343, §103 (a) (3), заменено «31 декабря 2016 г.» на «31 декабря 2008 г.».

Подсек. (в) (3). Паб. L. 110–343, §103 (c) (2) (B), добавлен п. (3).

Подсек. (в) (4). Паб. L. 110–343, §104 (c), добавлен п. (4).

2007 — Подст. (c). Паб. L. 110–172, §11 (a) (8), во вводных положениях «раздел» заменен на «подраздел».

Подсек.(c) (1) (B), (2) (B). Паб. L. 110–172, §11 (a) (9), заменено «подраздел (a)» на «параграф (1)».

2006 — Подраздел. (a) (2) (A) (i) (II), (3) (A) (ii). Паб. L. 109–432, §207 (1), заменено «1 января 2009 г.» на «1 января 2008 г.».

Подсек. (c) (1) (E), (2) (E). Паб. L. 109–432, §207 (2), заменено «31 декабря 2008 г.» на «31 декабря 2007 г.».

2005 — Подраздел. (а) (1). Паб. L. 109–135, §412 (m), заменены «параграфы (1) (B) и (2) (B) подпункта (c)» на «параграф (1) (B) или (2) (B)». подпункта (d) ».

Паб. L. 109–58, §1336 (d), вставлен «кроме случаев, предусмотренных в параграфе (1) (B) или (2) (B) подраздела (d)» перед «энергетическим кредитом».

Подсек. (а) (2) (А). Паб. L. 109–58, §1337 (a), изменен заголовок без изменений и исправлен текст подпункта. (А) в общем. До внесения поправок текст гласил: «Процент энергии составляет –

.

«(i) в случае квалифицированной собственности топливных элементов – 30 процентов, и

«(ii) в случае любой другой энергетической собственности – 10 процентов.”

Паб. L. 109–58, §1336 (c), изменен заголовок без изменений и исправлен текст подпункта. (А) в общем. До внесения поправок текст гласил: «Процент энергии составляет 10 процентов».

Подсек. (а) (3) (А) (i). Паб. L. 109–58, § 1337 (c), после слов «солнечное технологическое тепло» добавлено «за исключением собственности, используемой для выработки энергии для обогрева плавательного бассейна».

Подсек. (а) (3) (А) (ii). Паб. L. 109–135, §412 (n) (2), вычеркнуто «или» в конце.

Паб. Л.109–58, §1337 (b), добавлен п. (ii). Бывший кл. (ii) изменение названия (iii) в отношении оборудования, используемого для производства, распределения или использования энергии, полученной из геотермальных месторождений.

Подсек. (а) (3) (А) (iii). Паб. L. 109–58, §1337 (b), переименованный в п. (ii) как (iii) в отношении оборудования, используемого для производства, распределения или использования энергии, полученной из геотермальных месторождений.

Паб. L. 109–58, §1336 (a), добавлен п. (iii) относящиеся к квалифицированным свойствам топливных элементов или квалифицированным свойствам микротурбин.

Подсек.(а) (3) (А) (iv). Паб. L. 109–135, §412 (n) (1), переименованный в п. (iii), относящиеся к квалифицированным свойствам топливных элементов или квалифицированным свойствам микротурбин, как (iv).

Подсек. (c). Паб. L. 109–58, §1336 (b), добавлен подст. (c).

2004 — Pub. L. 108–357, §322 (d) (2) (B), вычеркнуто «; кредит на лесовозобновление »после« Энергетический кредит »в разделе« Линии ».

Подсек. (а) (3). Паб. L. 108–357, §710 (e), вставленный в конце заключительных положений «Такой термин не включает какое-либо имущество, которое является частью объекта, производство на котором разрешено в качестве кредита в соответствии с разделом 45 за налоговый год или любой другой предыдущий налоговый год. ”

Подсек. (а) (5). Паб. L. 108–357, §322 (d) (2) (A) (iii), переименованный в подст. (a) (5) как (b).

Паб. L. 108–357, §322 (d) (2) (A) (ii), заменено «подраздел (a)» на «этот подраздел».

Подсек. (б). Паб. L. 108–357, §322 (d) (2) (A) (iii), переименованный в подст. (a) (5) как (b).

Паб. L. 108–357, §322 (d) (2) (A) (i), зачеркнутый заголовок и текст подпункта. (б). Текст гласит:

.

«(1) В целом. – Для целей раздела 46 кредит на лесовосстановление за любой налоговый год составляет 10 процентов от части амортизируемой базы любой квалифицированной лесной собственности, которая была приобретена в течение такого налогового года и принимается во внимание. согласно разделу 194 (после применения раздела 194 (b) (1)).

«(2) Определения. – Для целей данной части термины« амортизируемая основа »и« квалифицированная древесина »имеют соответствующие значения, данные этим терминам в разделе 194».

1992 – пп. (а) (2). Паб. L. 102–486 заменил «The» на «За исключением случаев, предусмотренных в подпункте (B), the» в подпункте. (A), переименован в подпар. (C) как (B) и вычеркнуты бывшие подпар. (B) который гласит: «(B) Прекращение действия. – Начиная с периодов после 30 июня 1992 г., процент энергии равен нулю.Для целей предыдущего предложения применяются правила, аналогичные правилам раздела 48 (m) (действовавшим за день до даты вступления в силу Закона о согласовании доходов 1990 года) ».

1991 – п. (а) (2) (В). Паб. L. 102–227 заменено «30 июня 1992 г.» на «31 декабря 1991 г.».

1990 – Pub. L. 101–508, §11813 (a), поправка к разделу в целом, замена улова раздела на тот, который гласил: «Определения; особые правила »и в тексте, заменяющем настоящие положения на положения, определяющие имущество по разделу 38, новое имущество по разделу 38, бывшее в употреблении имущество по разделу 38, положения, касающиеся определенного арендуемого имущества, имений и трастов, специальных правил для квалифицированных отремонтированных зданий, кредита на кино- и телефильмы. , обращение с энергетической собственностью, применение определенных переходных правил, определения определенных кредитов, определение одноцелевой сельскохозяйственной или садоводческой структуры, корректировка основы для собственности согласно разделу 38, определенных организаций раздела 501 (d), специальные правила, касающиеся звукозаписей, и перекрестная ссылка на раздел 381 этого заголовка.

Подсек. (а) (8). Паб. L. 101–508, §11801 (c) (6) (A), зачеркнутый абз. (8) «Амортизированное имущество», которое гласит: «Любое имущество, в отношении которого применяется выбор в соответствии с разделом 167 (k), 184 или 188, не рассматривается как имущество раздела 38».

1988 – п. (а) (1). Паб. L. 100–647, §1002 (a) (29), который направил поправку к п. (1) путем замены «имущества, на которое распространяется действие статьи 168» на «имущество, подлежащее восстановлению (в значении статьи 168)» в предпоследнем предложении, было выполнено путем замены на «имущество, на которое распространяется действие статьи 168», которое приводит к сохранению оставшегося материала в скобках и закрывающей скобки.

Подсек. (а) (5) (А) (ii). Паб. L. 100–647, §1002 (a) (14) (A) – (C), заменено «168 (h) (2) (C)» на «168 (j) (4) (C)», « 168 (h) (2) (A) (iii) »для« 168 (j) (4) (A) (iii) »и« 168 (h) (2) (B) »для« 168 (j) ». (4) (B) ».

Подсек. (а) (5) (В) (i). Паб. L. 100–647, §1002 (a) (14) (D), заменено «168 (i) (3)» на «168 (j) (6)».

Подсек. (а) (5) (В) (ii). Паб. L. 100–647, §1002 (a) (14) (E), заменено «168 (h) (1) (C) (ii)» на «168 (j) (3) (C) (ii)». .

Подсек. (а) (5) (D). Паб. L. 100–647, §1002 (a) (14) (F), заменил «параграфы (5) и (6) статьи 168 (h)» на «параграфы (8) и (9) статьи 168 (j)». ) ».

Подсек. (а) (5) (Е). Паб. L. 100–647, §1002 (a) (14) (G), подпункт с поправками (E) как правило, замена «положения» на «положения» и «168 (h)» на «168 (j)».

Подсек. (1) (2) (С). Паб. L. 100–647, §1002 (a) (30), замененный «к которому применяется раздел 168» на «который является собственностью взыскания (в значении раздела 168)».

Подсек. (l) (11) (A) (ii). Паб. L. 100–647, §1013 (a) (41), заменил «облигацию на частную деятельность (в значении статьи 141)» на «облигацию на промышленное развитие (в значении статьи 103 (b) (2)). ».

Подсек. (s). Паб. L. 100–647, §1002 (a) (20), переименованный в подст. (s), относящийся к перекрестной ссылке, как (t).

Подсек. (s) (9). Паб. L. 100–647, §1002 (a) (16) (A), добавлен п. (9).

Подсек. (т). Паб. L. 100–647, §1002 (a) (20), переименованный в подст. (s), относящийся к перекрестной ссылке, как (t).

1986 – п. (а) (2) (В) (vii). Паб. L. 99–514, §§1272 (d) (5), 1275 (c) (5), вычеркнуто «932» после «931» и «или которое имеет право на преимущества раздела 934 (b)». »После« действует в соответствии с разделом 936 »и заменено« или 933 »на«, 933 или 934 (c) ».

Подсек. (а) (4). Паб. L. 99–514, §1802 (a) (9) (A), заменен «514 (b)» на «514 (c)» и «514 (a)» на «514 (b)».

Подсек. (a) (5) (B) (iii). Паб. L. 99–514, §1802 (a) (5) (B), вычеркнуто кл. (iii) при условии, что (I) в случае любого воздушного судна, используемого в рамках соответствующей аренды (как определено в разделе 47 (a) (7) (C)) и которое передано в аренду иностранному физическому или юридическому лицу до 1 января, 1990, пункт (i) должен применяться путем замены «3 года» на «6 месяцев» и того, что (II) для целей применения статьи 47 (a) (1) и (5) (B) не должен учитываться учитывать любой период аренды, к которому применяется подпункт (I).

Подсек. (а) (5) (D), (E). Паб. L. 99–514, §1802 (a) (4) (C), добавлен подпункт. (D) и переименован в бывшую подпарку. (D) как (E).

Подсек. (б) (1). Паб. L. 99–514, §1809 (e) (1), добавлен «Такой термин включает в себя любую собственность по разделу 38, реконструкция которой завершена налогоплательщиком, но только в отношении той части основы, которая должным образом отнесена на реконструкция ».

Подсек. (Би 2). Паб. L. 99–514, §1809 (e) (2), во вводных положениях заменено «первое предложение параграфа (1)» на «параграф (1)» в подпункте.(B) заменил «через 3 месяца после» на «3 месяца», в заключительных положениях заменил «используется по обратной аренде (или аренде), упомянутой в подпункте (B)» на «используется по договору аренды» и вставил «Предыдущее предложение не применяется к какому-либо имуществу, если арендатор и арендодатель такого имущества выбирают в соответствии с этим предложением. Такие выборы, однажды сделанные, могут быть отменены только с согласия Секретаря ».

Подсек. (d) (4) (D). Паб. L. 99–514, §701 (e) (4) (C), добавлен «(действует за день до даты вступления в силу Закона о налоговой реформе 1986 года)».

Подсек. (d) (6) (C) (ii). Паб. L. 99–514, §1511 (c) (3), заменил «ставку недоплаты» на «ставку» в заключительных положениях.

Подсек. (g) (1). Паб. L. 99–514, §251 (b), пар. (1) как правило, повторяя подпункты. (A) – (D) положения, относящиеся к квалифицированным отремонтированным зданиям, которые находились в подпункте. (A) предоставлено общее определение квалифицированного реабилитированного здания в подпункте. (B) постановил, что с момента строительства должно пройти 30 лет в подпункте. (C) предоставил общее определение существенно реабилитированного с особым правилом для поэтапного восстановления и применения положений к арендаторам, а также в подпункте.(D) при условии, что реабилитация включала реконструкцию и вычеркивание бывшего некачественного. (E), который предоставил альтернативный тест для определения квалифицированного реабилитированного здания.

Подсек. (g) (2). Паб. L. 99–514, §251 (b), пар. (2) как правило, в подп. (А) вычеркивая ссылку на суммы, «понесенные после 31 декабря 1981 г.» во вводном положении, и в п. (i) заменяя подп. (I) – (IV) для «недвижимого имущества (или дополнений или улучшений недвижимого имущества), для которого период восстановления (в значении статьи 168) составляет 19 (15 лет в случае жилья для малоимущих) лет, ”, В подпар.(B), в п. (i), заменяя положение, касающееся использования линейной амортизации, резерва, относящегося к использованию ускоренных методов начисления амортизации, изменяя формулировку бывшего п. (vi) на (v) и заменяя «раздел 168 (h)» на «раздел 168 (j)», изменяя название бывшего п. (v) как (vi) и заменив «менее периода восстановления, определенного в соответствии с разделом 168 (c)» на «менее 19 лет (15 лет в случае жилья для малоимущих», пересчитав подпункт (C) без изменений и в подпункте (D) замену положений, определяющих нежилую недвижимость, жилую недвижимость, сдаваемую внаем, и классовую жизнь, положениями, определяющими жилье для малоимущих.

Подсек. (g) (2) (B) (vi) (I). Паб. L. 99–514, §1802 (a) (9) (B), заменен «раздел 168 (j)» на «раздел 168 (j) (3)».

Подсек. (g) (3). Паб. L. 99–514, §251 (b), с поправками, внесенными в пар. (3) как правило, добавлена ​​вводная фраза «Для целей данного подраздела -».

Подсек. (g) (4). Паб. L. 99–514, §251 (b), с поправками, внесенными в подст. (g) в целом, пар. (4) без изменений.

Подсек. (1) (5). Паб. L. 99–514, § 1847 (b) (6), заменено «раздел 23 (c)» на «раздел 44C (c)» и «раздел 23 (c) (4) (A) (viii)» на « раздел 44C (c) (4) (A) (viii) ».

Подсек. (q) (3). Паб. L. 99–514, §251 (c), вычеркнуто «кроме сертифицированного исторического сооружения» после «квалифицированное восстановленное здание».

Подсек. (q) (7). Паб. L. 99–514, §1809 (d) (2), нумерация пар. (6), относящееся к специальному правилу для квалифицированных фильмов, как (7).

Подсек. (р). Паб. L. 99–514, §1879 (j) (1), добавлен подст. (р). Бывший подст. (r) переименованы.

Подсек. (s). Паб. L. 99–514, § 1879 (j) (1), переименован в бывший подст. (r) как (s).

Подсек.(s) (5). Паб. L. 99–514, §803 (b) (2) (B), которым предписано общее изменение п. (5) подст. (r), было выполнено изменение пар. (5) подст. (s) отразить вероятное намерение Конгресса и промежуточное изменение названия подраздела. (r) as (s) от Pub. L. 99–514, §1879 (j) (1), см. Примечание выше. До внесения изменений в п. (5) читать следующим образом: «Для целей данного подраздела термин« звукозапись »означает любую звукозапись, описанную в разделе 280 (c) (2)».

1985 — Подсек. (g) (2) (A) (i), (B) (v).Паб. Л. 99–121 заменил «19» на «18».

1984 — Подст. (а) (5). Паб. L. 98–369, §31 (b), пар. (5) в целом, чтобы расширить его сферу, чтобы охватить имущество, используемое иностранными физическими или юридическими лицами, и создать исключение для краткосрочной аренды путем замены положений, предусмотренных подпунктами. (A) – (D) для прежних положений, которые предписывали, что это имущество, используемое Соединенными Штатами, любым штатом или его политическим подразделением, любой международной организацией, или любым агентством или инструментом любого из вышеперечисленного, не должно рассматриваться как собственность раздела 38, что для целей этого запрета Международный консорциум спутниковой связи, Международная организация морской спутниковой связи и любая организация-преемник такого Консорциума или Организации не должны рассматриваться как международная организация, и что если какое-либо квалифицированное отремонтированное здание использовалось правительственным подразделением в соответствии с В случае аренды этот пункт не будет применяться к той части основы такого здания, которая относится к квалифицированным расходам на восстановление.

Подсек. (б). Паб. L. 98–369, §114 (a), исправленный подст. (b) как правило, заменяя общее определение «нового имущества по разделу 38» на определения, в которых содержится ссылка на имущество, построенное, реконструированное или возведенное после 31 декабря 1961 года, и добавляя абзацы. (2) и (3).

Подсек. (в) (2) (А). Паб. L. 98–369, §11 (a), заменил «125 000 долларов (150 000 долларов для налоговых лет, начинающихся после 1987 года)» на «150 000 долларов (125 000 долларов для налоговых лет, начинающихся в 1981, 1982, 1983 или 1984 годах)» в первом предложении, и «125 000 долларов США (или 150 000 долларов США») вместо «150 000 долларов США (или 125 000 долларов США») в двух местах во втором предложении.

Подсек. (c) (2) (B). Паб. L. 98–369, §11 (b), заменено «62 500 долларов (75 000 долларов для налоговых лет, начинающихся после 1987 года)» на «75 000 долларов (62 500 долларов для налоговых лет, начинающихся в 1981, 1982, 1983 или 1984 годах)».

Подсек. (c) (3) (B). Паб. L. 98–369, §474 (o) (10), заменено «раздел 39» на «раздел 46 (b)».

Подсек. (d) (1) (B). Паб. L. 98–369, §474 (o) (11), заменено «раздел 38 (c) (3) (B)» на «раздел 46 (a) (6)».

Подсек. (г) (6). Паб. L. 98–369, §431 (c), добавлен п.(6).

Подсек. (е) (3). Паб. L. 98–369, §474 (o) (12), вычеркнутый абз. (3) при условии, что сумма в размере 25000 долларов, указанная в подпунктах (A) и (B) раздела 46 (a) (3), применимая к имущественному комплексу или доверительному фонду, будет уменьшена до суммы, которая имеет такое же соотношение, в 25000 долларов, как сумма квалифицированные инвестиции, выделенные в недвижимость или траст в соответствии с параграфом (1), на всю сумму квалифицированных инвестиций.

Подсек. (g) (1) (E). Паб. L. 98–369, §1043 (a), добавлен подпункт. (E).

Подсек. (g) (2) (A) (i). Паб. L. 98–369, §111 (e) (8) (A), (B), заменил «недвижимость» на «собственность» в двух местах и ​​«18 (15 лет в случае жилья для малоимущих). »Для« 15 ».

Подсек. (g) (2) (B) (i). Паб. L. 98–369, §31 (c) (2), добавлен «Предыдущее предложение не применяется к каким-либо расходам в той мере, в какой к таким расходам применяется подраздел (f) (12) или (j) статьи 168».

Подсек. (g) (2) (B) (v). Паб. L. 98–369, §111 (e) (8) (C), заменил «18 лет (15 лет в случае жилья с низким доходом)» на «15 лет».

Подсек. (g) (2) (B) (vi). Паб. L. 98–369, §31 (c) (1), добавлен п. (vi).

Подсек. (g) (2) (D). Паб. L. 98–369, §111 (e) (8) (D), добавлен подпункт. (D).

Подсек. (k) (4). Паб. L. 98–369, §113 (b) (3) (B), в заголовке после слова «проверка» добавлено «правила для лиц, подверженных риску».

Подсек. (k) (4) (A). Паб. L. 98–369, §113 (b) (3) (A), добавлен «, раздел 46 (c) (8) или раздел 46 (c) (9)».

Подсек. (k) (4) (B). Паб. L. 98–369, §113 (b) (3) (C), заменено «использовано» на «выпущено».

Подсек.(k) (5) (D) (i). Паб. L. 98–369, §721 (x) (1), заменено «корпорация S» на «корпорацию малого бизнеса».

Подсек. (l) (1). Паб. L. 98–369, §474 (o) (13), заменено «раздел 46 (b) (2)» на «раздел 46 (a) (2) (C)».

Подсек. (l) (16) (B) (i). Паб. L. 98–369, §735 (c) (1), заменено «шасси которого является шасси автомобильного автобуса, а кузов – кузовом автомобильного автобуса» на «шасси и кузов которого освобождены от налогообложения в соответствии с разделом 4063. (a) (6) от налога, взимаемого в соответствии с разделом 4061 (a) ».

Подсек. (м). Паб. L. 98–369, §474 (o) (14), заменено «подраздел (b)» на «подраздел (a) (2)».

Подсек. (п). Паб. L. 98–369, §474 (o) (15), отмененный подст. (п). Для продолжения применимости абз. (4) подст. (n), см. раздел 474 (o) (15) Pub. L. 98–369, изложенный ниже в Примечании к поправке 1984 г. Дата вступления в силу.

Подсек. (o) (3) – (8). Паб. L. 98–369, §474 (o) (16), измененное название пар. (8) как (3) и вычеркнуты бывшие пар. (3) – (7), которые определяют «кредит по плану сотрудника», «кредит по базовому плану сотрудника», «кредит по соответствующему плану сотрудника», «процент базового плана сотрудника» и «соответствующий процент по плану сотрудника», соответственно.

Подсек. (q) (1), (3). Паб. L. 98–369, §474 (o) (17) (A), заменен «раздел 46 (a)» на «раздел 46 (a) (2)».

Подсек. (q) (4) (A) (i). Паб. L. 98–369, §474 (o) (17), заменены «раздел 46 (a)» на «раздел 46 (a) (2)» и «раздел 46 (b) (1)» на «раздел 46 ( a) (2) (B) ».

Подсек. (q) (4) (B) (ii). Паб. L. 98–369, §474 (o) (17) (B), заменен «раздел 46 (b) (1)» на «раздел 46 (a) (2) (B)».

Подсек. (q) (6). Паб. L. 98–369, §712 (b), добавлен п. (6) относящиеся к корректировке основы интереса в партнерстве или S-корпорации.

Паб. L. 98–369, §113 (b) (4), добавлен абз. (6) относящиеся к особому правилу для квалифицированных фильмов.

Подсек. (р). Паб. L. 98–369, §113 (a) (1), добавлен подст. (р). Бывший подст. (r) переименованы.

Паб. L. 98–369, §474 (o) (18), заменено «раздел 381 (c) (26)» на «раздел 381 (c) (23)».

Подсек. (s). Паб. L. 98–369, §113 (a) (1), прежний подст. (r) как (s).

1983 – п. (а) (1) (G). Паб. L. 97–448, §102 (e) (2) (A), после слов «хранилище» добавлено «(не включая здание и его структурные компоненты), используемые в связи».

Подсек. (а) (10). Паб. L. 97–448, §202 (c), измененный язык справочника Pub. L. 96–223, §223 (a) (1), чтобы исправить ошибку, и не предполагал никаких изменений в тексте. См. Примечание к поправке 1980 г. ниже.

Подсек. (g) (1) (C) (i). Паб. L. 97–448, §102 (f) (2), (6), заменены «24-месячный период, выбранный налогоплательщиком (во время и в порядке, установленном нормативными актами) и заканчивающийся в налоговом году или в течение этого налогового года. »Для« 24-месячного периода, заканчивающегося в последний день налогового года »в положениях, предшествующих пп.(I), заменили «скорректированное основание такого здания (и его структурных элементов)» на «скорректированное основание такого имущества» как в пп. (I) и в положении после пп. (II), а в положениях, следующих за пп. (II), заменено «период владения зданием» на «период владения недвижимостью» и добавлено положение о том, что для целей предыдущего предложения определение начала периода владения должно производиться без учета какой-либо реконструкции налогоплательщику в связи с реабилитацией.

Подсек. (g) (5) (A). Паб. L. 97–448, §102 (f) (3), заменено «кредит определен в соответствии с разделом 46 (a) (2)» на «кредит разрешен в соответствии с данным разделом» и «кредит определен таким образом» на « кредит так разрешен ». См. Примечание к поправке 1982 г. для подст. (g) (5) ниже и см. Дату вступления в силу 1982 и 1983 поправок, изложенных в разделах 1 и 196 настоящего заголовка.

Подсек. (1) (5). Паб. L. 97–424, §546 (a) (3), заменена ссылка на подпункт. (N) для ссылки на подпункт.(M) в положении, следующем за подпунктами.

Подсек. (l) (5) (M), (N). Паб. L. 97–424, §546 (a) (1), (2), добавлен подпункт. (M) и переименован в бывшую подпарку. (M) как (N).

Подсек. (q) (3). Паб. L. 97–448, §306 (a) (3), заменил «параграфы (1) и (2) этого подраздела и параграф (5) подраздела (d)» на «параграфы (1) и (2)» .

1982 — Подсек. (б). Паб. L. 97–248, §209 (c), добавлено положение о том, что для целей определения того, является ли имущество по разделу 38, подлежащее аренде, новым имуществом по разделу 38, такое имущество должно рассматриваться как первоначально введенное в эксплуатацию не ранее даты, когда такое имущество используется по договору аренды, но только в том случае, если такое имущество сдается в аренду в течение 3 месяцев после ввода такого имущества в эксплуатацию.

Подсек. (c) (2) (D). Паб. L. 97–354 заменил «Партнерства и S-корпорации» на «Партнерства» в подпункте. заголовок и добавлен «Аналогичное правило применяется в случае корпорации S и ее акционеров».

Подсек. (г) (5). Паб. L. 97–248, §205 (a) (4), добавлен п. (5).

Подсек. (е). Паб. L. 97–354, §5 (a) (7), вычеркнутый подст. (e) относящиеся к распределению между акционерами квалифицированных инвестиций выбирающей корпорацией малого бизнеса.

Подсек.(g) (5). Паб. L. 97–248, §205 (a) (5) (A), зачеркнутый абз. (5) с поправками, внесенными в соответствии с §102 (f) (3) Pub. Закон № 97–448 предусматривал, что для целей этого подзаголовка, если в соответствии с разделом 46 (a) (2) был определен кредит для любых квалифицированных расходов на реконструкцию в связи с квалифицированным отремонтированным зданием, отличным от сертифицированного исторического здания, увеличение на основе такого имущества, которое (кроме этого параграфа) возникло бы в результате таких расходов, должно было быть уменьшено на сумму кредита, определенную таким образом, чтобы если в течение любого налогового года была определена сумма возврата в отношении любого квалифицированного восстановленного здания основание которого было сокращено под подпар.(A), основание для такого здания (непосредственно перед событием, которое привело к такому повторному поимку), должно было быть увеличено на сумму, равную такой повторной поимке, и что для целей этого параграфа «сумма повторного поимки» определялась как любое увеличение налог (или корректировка переноса или перенесенного остатка), определенный в соответствии с разделом 47 (a) (5). См. Примечание к поправке 1983 г. для подст. (g) (5) выше и см. Примечания к поправкам к дате вступления в силу 1982 и 1983 годов, изложенные в разделах 1 и 196 настоящего заголовка.

Подсек.(k) (5) (D) (i). Паб. L. 97–354, §5 (a) (8), заменено «корпорация S» на «выбирающую корпорацию малого бизнеса (в значении раздела 1371)».

Подсек. (l) (7). Паб. L. 97–362, §104 (a), временно заменено оговоркой, что такой термин не включает оборудование для гидрогенизации, рафинирования или другого процесса, следующего за автоклавированием, кроме гидрогенизации или другого процесса, который применяется в непосредственной близости от собственности от который сланец был извлечен и который применяется для доведения сланцевого масла до уровня и качества, подходящего для транспортировки и переработки на нефтеперерабатывающем заводе, для квалификации, что такое оборудование не включает оборудование для гидрогенизации, рафинирования или других процессов, следующих за автоклавированием. .См. Ниже примечание о датах вступления в силу и прекращении действия поправки 1982 года.

Подсек. (д), (г). Паб. L. 97–248, §205 (a) (1), добавлен подст. (q) и переименовали бывшую подпункт. (q) как (r).

1981 – п. (а) (1). Паб. L. 97–34, §211 (e) (4), в положениях, следующих за пп. (G), замененный «Такой термин включает только имущество восстановления (в значении раздела 168 без учета какого-либо срока полезного использования) и любое другое имущество» на «Такой термин включает только имущество».

Подсек.(а) (1) (G). Паб. L. 97–34, §211 (c), добавлен подпункт. (ГРАММ).

Подсек. (а) (2) (В) (ii). Паб. L. 97–34, §211 (h), существующие положения обозначены как подп. (I) и добавил пп. (II).

Подсек. (а) (3) (D). Паб. L. 97–34, §212 (c), добавлен подпункт. (D).

Подсек. (а) (4). Паб. L. 97–34, §214 (a), добавлено положение о том, что, если какое-либо квалифицированное отремонтированное здание используется организацией, освобожденной от налогов в соответствии с договором аренды, этот параграф не применяется к той части основы такого здания, которая является связано с квалифицированными расходами на реабилитацию.

Подсек. (а) (5). Паб. L. 97–34, §214 (b), добавлено положение о том, что, если какое-либо квалифицированное отремонтированное здание используется правительственной единицей в соответствии с договором аренды, этот параграф не применяется к той части основы такого здания, которая относится к квалифицированные расходы на реабилитацию.

Подсек. (а) (8). Паб. L. 97–34, §212 (d) (2) (A), заменено «или 188» на «188, или 191».

Подсек. (а) (9). Паб. L. 97–34, §211 (a) (2), вычеркнутый абз. (9) которые устанавливают особые правила амортизации железнодорожных путей.

Подсек. (c) (2) (A) – (C). Паб. L. 97–34, §213 (a), подпункты с поправками. (A) – (C) обычно повышается в подпункте. (A) существующее ограничение в 100 000 долларов до 125 000 долларов в 1981 году и до 150 000 долларов в 1985 году и ниже. (B) существующее ограничение в 50 000 долларов до 62 500 долларов в 1981 году и до 75 000 долларов в 1985 году.

Подсек. (грамм). Паб. L. 97–34, §212 (b), в подст. (c) в целом включили понятие «существенная реабилитация» в абз. (1) (A), заменить «30 лет» на «20 лет» в качестве необходимого периода в п.(1) (B) заменил определение «в значительной степени восстановленное» на прежние положения, согласно которым большая часть может рассматриваться как отдельное здание в определенных случаях в п. (1) (C), пар. (1) (D) без изменений, заменено «31 декабря 1981 г.» на «31 октября 1978 г.» в положениях п. (2) (A) предыдущего п. (i) заменили резервы на период возмещения в 15 лет для резервов, которые предусматривали срок полезного использования 5 лет или более в п. (i) п. (2) (A), реконструкция п. (ii) без изменений замененные положения о том, что ускоренные методы начисления амортизации не могут использоваться для положений, относящихся к собственности, в противном случае раздел 38 «Имущество» в п.(i) п. (2) (B), реконструкция пп. (ii) и (iii) без изменений, изменили положения п. (iv) относящиеся к сертифицированным историческим строениям, и добавлен п. (v) в отношении расходов арендаторов, добавлен п. (3), прежний пар. (3) как (4) и добавил п. (5).

Подсек. (1) (2) (С). Паб. L. 97–34, §211 (e) (3), после слов «3 года или более» добавлено «или которое является собственностью для восстановления (в значении статьи 168)».

Подсек. (n) (1) (A) (i). Паб. L. 97–34, §332 (b), заменено «который не превышает» на «равно».

Подсек. (о) (8). Паб. L. 97–34, §212 (a) (3), добавлен п. (8).

1980 – п. (а) (1). Паб. Л. 96–451, доп. (F) и положение об учете срока полезного использования не соответствующе. (F) собственность как нормальный период роста.

Подсек. (а) (2) (В) (xi). Паб. L. 96–223, §222 (i) (2), добавлен кл. (xi).

Подсек. (а) (5). Паб. L. 96–605, §109 (a), включает Международную организацию морской спутниковой связи или любую организацию-преемницу в рамках организаций, которые не должны рассматриваться как международные организации.

Подсек. (а) (7) (В). Паб. L. 95–600, §312 (c) (2), с поправками, внесенными Pub. L. 96–222, §103 (a) (2) (A), заменено «описанным в разделе 50 (действовавшим до его отмены Законом о доходах 1978 года» »на« описанным в разделе 50 »».

Подсек. (а) (10) (А). Паб. L. 96–223, §223 (a) (1), с поправками, внесенными Pub. L. 97–448, §202 (c), при условии, что «нефть или нефтепродукты» не включают нефтяной кокс или нефтяной пек.

Подсек. (а) (10) (В). Паб. L. 96–222, §108 (c) (6), заменено «5» на «51».

Подсек. (g) (2) (B) (i). Паб. L. 96–222, §103 (a) (4) (B), заменены «подразделами (a) (1) (E) и (l)» на «подраздел (a) (1) (E)».

Подсек. (l) (1). Паб. L. 96–223, §221 (b) (1), замененный «Для любого периода, для которого процент энергии, определенный в соответствии с разделом 46 (a) (2) (C) для любого энергетического свойства, больше нуля» на «Для период, начинающийся 1 октября 1978 г. и заканчивающийся 31 декабря 1982 г. »в положениях, предшествующих подпункту. (A) и в подпунктах. (A) и (B) заменить «такое энергетическое свойство» и «такое свойство» на «любое энергетическое свойство».

Подсек. (1) (2) (А). Паб. L. 96–223, §222 (a), добавлены пп. (vii), (viii) и (ix).

Подсек. (1) (3) (А). Паб. L. 96–223, §222 (b), (g) (2), вычеркнуто «(кроме кокса или коксового газа)» после «твердое топливо» в п. (iii) и в п. (v) замененные положения, касающиеся оборудования, которое преобразует уголь в заменитель сырья, полученного из нефти или природного газа, для производства химикатов или других продуктов и оборудования, которое преобразует уголь в метанол, аммиак или жидкий или твердый уголь, подвергнутый гидрообработке, для продуктов, которые относились просто к оборудованию, которое использовало уголь в качестве сырья для производства химикатов или других продуктов, кроме кокса или коксового газа, добавлен кл.(ix), и, следуя п. (ix) добавлено положение о том, что оборудование, описанное в п. (vii) включает оборудование, используемое для хранения топлива, полученного из мусора на участке, на котором такое топливо было произведено из мусора.

Подсек. (1) (3) (В). Паб. L. 96–223, §222 (i) (1) (A), переименован в подпункт. (C) как (B). Бывший некачественный. Пункт (B), который исключал коммунальную собственность из терминов «собственность на альтернативную энергию», «собственность на солнечную или ветровую энергию» или «оборудование для рециркуляции», был исключен.

Подсек.(l) (3) (C), (D). Паб. L. 96–223, §222 (i) (1) (A), (3), переименован в подпункт. (D) как (C) и вставлен после п. (ii) положение о том, что для целей предыдущего предложения в случае собственности, которая является собственностью, относящейся к альтернативным источникам энергии, исключительно по причине поправок, внесенных в раздел 222 (b) Закона о налоге на непредвиденную прибыль от сырой нефти от 1980 г., «Январь 1 октября 1980 года »было заменено на« 1 октября 1978 года ». Бывший некачественный. (C) переименован (B).

Подсек. (1) (4) (С). Паб. L. 96–223, §222 (c), добавлен подпункт.(С).

Подсек. (1) (5). Паб. L. 96–223, §222 (d), добавлен подпункт. (L), переименован в бывшую подпарку. (L) как (M) и добавлено положение о том, что Секретарь не должен указывать какое-либо имущество в соответствии с подпунктом. (M), если он не определит, что такая спецификация соответствует требованиям абз. (9) раздела 44C (c) для спецификации товаров в соответствии с разделом 44C (c) (4) (A) (viii).

Подсек. (1) (11). Паб. L. 96–223, §221 (b) (2), заменил «половину процента энергии, определенного в соответствии с разделом 46 (a) (2) (C)» на «5 процентов».

Паб. L. 96–223, §223 (c) (1), полностью измененный пар. (11) включить собственность, финансируемую за счет субсидированного финансирования энергетики, действующего в отношении периодов после 31 декабря 1982 г. До пересмотра п. (11) гласит следующее: «В случае собственности, которая полностью или частично финансируется за счет доходов от облигаций промышленного развития (в значении статьи 103 (b) (2)), проценты по которой освобождены от уплаты налогов. налог в соответствии с разделом 103, процент энергии должен составлять половину процента энергии, определенного в соответствии с разделом 46 (a) (2) (C).”

Подсек. (1) (13). Паб. L. 96–223, §222 (e) (1), добавлен п. (13).

Подсек. (l) (14). Паб. L. 96–223, §222 (f), добавлен п. (14).

Подсек. (1) (15). Паб. L. 96–223, §222 (g) (1), добавлен п. (15).

Подсек. (l) (16). Паб. L. 96–223, §222 (h), добавлен п. (16).

Подсек. (l) (17). Паб. L. 96–223, §222 (i) (1) (B), добавлен п. (17).

Подсек. (п). Паб. Л. 96–222, §101 (a) (7) (G), (H), (L) (i) (I) – (IV), (ii) (III) – (VI), (iii) (II), (v) (II) – (IV), (M) (ii) с поправками, внесенными в подст.(n) как правило, чтобы отразить переименование инвестиционного налогового кредита ESOP в план владения акциями служащего с налоговым кредитом, а план владения акциями служащего (обычно называемый ESOP) в план владения акциями служащего.

Подсек. (n) (6) (B) (i). Паб. L. 96–605, §223 (a), заменил «дату внесения ценных бумаг в план» на «срок подачи декларации за налоговый год (определяемый с учетом продлений)».

Подсек. (о). Паб.L. 96–222, §101 (a) (7) (L) (iii) (III), (v) (IV), (V), (M) (iii), «план сотрудников» заменен на «ESOP. »Везде, где указано, и вставлено« процент »после« относящийся к соответствующему плану сотрудников »в п. (5).

1978 – п. (а) (1) (А). Паб. L. 95–618, §301 (d) (1), добавлено «(кроме кондиционера или обогревателя)» после «личного имущества».

Подсек. (а) (1) (D). Паб. L. 95–600, §314 (a), добавлен п. (D).

Подсек. (а) (1) (Е). Паб. L. 95–600, §315 (a), добавлен п.(E).

Подсек. (а) (2) (В) (ii). Паб. L. 95–473, §2 (a) (2) (A), заменено «обеспечение перевозки в соответствии с подразделом I главы 105 раздела 49» на «в соответствии с частью I Закона о торговле между штатами».

Подсек. (а) (7) (А). Паб. L. 95–600, §312 (c) (3), вычеркнуто «(кроме свойства предварительного определения)» после «Собственность».

Подсек. (а) (7) (В). Паб. L. 95–600, §312 (c) (2), вычеркнуто «описано в разделе 50» после «в отношении собственности». См. Примечание к поправке 1980 г. выше.

Подсек. (а) (8). Паб. L. 95–600, §315 (c), заменено «или 188» на «188 или 191».

Подсек. (а) (10). Паб. L. 95–618, §301 (d) (2), добавлен п. (10).

Подсек. (d) (1) (B). Паб. L. 95–600, §703 (a) (3), заменено «раздел 46 (a) (6)» на «раздел 46 (a) (5)».

Подсек. (d) (4) (D). Паб. L. 95–600, §703 (a) (4), заменено «раздел 57 (c) (1) (B)» на «раздел 57 (c) (2)».

Подсек. (грамм). Паб. L. 95–600, §315 (b), добавлен подст. (грамм).

Подсек.(час). Паб. L. 95–600, §312 (c) (1), вычеркнутый подст. (h) которые связаны с приостановкой инвестиционного кредита.

Подсек. (я). Паб. L. 95–600, §312 (c) (1), вычеркнутый подст. (i) что связано с освобождением от приостановления инвестирования 20 000 долларов США.

Подсек. (j). Паб. L. 95–600, §312 (c) (1), вычеркнутый подст. (j) который определяет «период приостановки».

Подсек. (л), (м). Паб. L. 95–618, §301 (b), добавлены подразделы. (l) и (m) и переименованы в бывшую подпункт. (l) как (n).

Подсек. (п). Паб. L. 95–618, §301 (b), прежний подст. (l) как (n).

Паб. L. 95–600, §141 (b), добавлен подст. (п). Бывший подст. (n) переименован (p).

Подсек. (о). Паб. L. 95–600, §141 (b), добавлен подст. (о).

Подсек. (p), (q). Паб. L. 95–600, §§141 (b), 314 (b), добавлен подст. (п). Бывший подст. (n) переименован в (p), а затем в (q).

1976 – п. (а) (2) (В) (vi). Паб. L. 94–455, §1901 (a) (5) (A), замененный «(43 U.S.C. 1331)) »для«; 43 U.S.C., сек. 1331) ».

Подсек. (а) (2) (В) (vii). Паб. L. 94–455, §1051 (h) (1), заменено «(кроме корпорации, выборы которой действуют в соответствии с разделом 936 или которая имеет право на преимущества раздела 934 (b))» на «(другие чем корпорация, имеющая право на преимущества раздела 931 или 934 (b)) ».

Подсек. (а) (2) (В) (viii). Паб. L. 94–455, §1901 (a) (5) (B), заменено на «47 U.S.C. 702 »для« 47 U.S.C., sec. 702 ”.

Подсек. (а) (8). Паб.L. 94–455, §§1901 (b) (11) (A), 2112 (a) (1), вычеркнуто «169» после «раздел 167 (k)», «187» перед «или 188 », а также положения, касающиеся ограничения применимости этого параграфа к собственности, к которой применяется раздел 169.

Подсек. (c) (2) (A), (d) (1), (2) (A). Паб. L. 94–455, §1906 (b) (13) (A), вычеркнуто «или его представитель» после «Секретарь».

Подсек. (е). Паб. L. 94–455, §802 (b) (6), заменено «раздел 46 (a) (3)» на «раздел 46 (a) (2)».

Подсек.(i) (2). Паб. L. 94–455, §1906 (b) (13) (A), вычеркнуто «или его представитель» после «Секретарь».

Подсек. (k), (l). Паб. L. 94–455, §804 (a), добавлен подст. (k) и переименовали бывшую подпункт. (k) как подст. (л).

1975 – п. (а) (2) (В). Паб. L. 94–12, §604 (a), заменил «территориальные воды в северной части Западного полушария» на «территориальные воды» в п. (x) и добавлено определение «северной части Западного полушария» после п. (Икс).

Подсек.(в) (2) (А). Паб. L. 94–12 §301 (c) (1) (A), заменено «100 000 долларов» на «50 000 долларов».

Подсек. (c) (2) (B). Паб. L. 94–12, §301 (c) (1) (A), (B), заменил «50 000 долларов США» на «25 000 долларов США» и «100 000 долларов США» вместо «50 000 долларов США».

Подсек. (c) (2) (C). Паб. L. 94–12, §301 (c) (1) (A), заменил «100 000 долларов» на «50 000 долларов».

Подсек. (г) (1), (2) (А). Паб. L. 94–12, §302 (c) (3), заменено «раздел 46 (e) (1)» на «раздел 46 (d) (1)».

1971 – п. (а) (1). Паб. L. 92–178, §102 (a) (2), во втором предложении слова «3 года» заменены на «4 года».

Подсек. (a) (1) (B) (ii), (iii). Паб. L. 92–178, §104 (a) (1), заменено «исследовательское учреждение» на «исследовательское или хранилище» в п. (ii) и добавил п. (iii).

Подсек. (а) (2) (В). Паб. L. 92–178, §104 (c) (2), (3), (d), добавлены пп. (viii) – (x) соответственно.

Подсек. (а) (3) (В). Паб. L. 92–178, §104 (b), добавлен подпункт. (С).

Подсек. (а) (5). Паб. L. 92–178, §104 (c) (1), после слова «международная организация» добавлено «(кроме Международного телекоммуникационного спутникового консорциума или любой организации-преемника)».

Подсек. (а) (6). Паб. L. 92–178, §104 (e), заменены положения об обращении с домашним скотом (кроме лошадей), приобретенным налогоплательщиком как имуществом по статье 38, за исключением положения о снижении стоимости приобретения на сумму, равную сумме, реализованной при продаже или другом распоряжение при определенных обстоятельствах, а также в случае отсутствия обращения с лошадьми в качестве собственности по разделу 38 для прежнего положения о том, что домашний скот не должен рассматриваться как собственность по статье 38.

Подсек. (a) (7) – (9). Паб.L. 92–178, §§103, 104 (f) (1), (g), добавлены пар. (7) – (9) соответственно.

Подсек. (г). Паб. L. 92–178, §108 (b) и (c), заменены «раздел 46 (d) (1)» на «раздел 46 (d)»; и обозначен как п. (1) настоящее первое предложение, переименованное в подпункты. Положения (A) и (B), ранее обозначенные пп. (1) и (2), снова заменены «раздел 46 (d) (1)» на «раздел 46 (d)» в п. (1) и вставлен «(кроме собственности, описанной в параграфе (4))» в п. (1), добавлены пар. (2) и (4), включили положения бывших второго, третьего и четвертого предложений в положения, обозначенные как абз.(3), замененный в п. (3) «арендатор должен рассматриваться для всех целей данного подраздела как приобретший дробную часть такого имущества, равную доле, определенной в соответствии с параграфом (2) (B) в отношении такого имущества», поскольку «арендатор должен рассматриваться для всех целей этого подраздела как приобретение такого имущества », и вычеркнул бывшие пятое и шестое предложения в отношении выборов, касающихся обращения с арендой имущества на период приостановления и имущества раздела 38. См. Примечание о дате вступления в силу поправки 1971 года ниже.

1969 — Подсек. (а) (4). Паб. L. 91–172, §121 (d) (2) (A), добавлено положение, касающееся процентной доли базовой стоимости или стоимости финансируемой за счет долга собственности, которая может учитываться при расчете квалифицированных инвестиций в соответствии с разделом 46 (c) настоящего документа. заглавие.

Подсек. (c) (2) (C). Паб. L. 91–172, §401 (e) (2), реконструкция подпункта. (C) с небольшими изменениями и замененной ссылкой на контролируемую группу для ссылки на аффилированную группу.

Подсек. (c) (3) (C). Паб. L. 91–172, §401 (e) (3), определение контролируемой группы заменено на определение дочерней группы.

Подсек. (г) (2). Паб. L. 91–172, §401 (e) (4), замененная ссылка на составного члена контролируемой группы для ссылки на члена аффилированной группы.

1967 – п. (а) (2) (В) (i). Паб. L. 90–26, § 3, добавлен «или эксплуатируется по контракту с Соединенными Штатами» после «Соединенные Штаты».

Подсек. (з) (2). Паб. L. 90–26, §2 (a), ограниченное определение имущества периода приостановления до имущества раздела 38, физическое строительство, реконструкция или возведение которого было начато до 24 мая 1967 г., в соответствии с приказом, размещенным в период приостановления, с учетом при условии, что при применении определения к собственности, физическое строительство, реконструкция или возведение которой было начато до 24 мая 1967 года, во внимание принимается только та часть основания, которая должным образом отнесена к строительству, реконструкции или возведению до 24 мая 1967 года.

Подсек. (j). Паб. L. 90–26, § 1, заменено «9 марта 1967 г.» на «31 декабря 1967 г.».

1966 — Подсек. (а) (2) (В). Паб. Л. 89–809 доп. П. (vii).

Подсек. (г). Паб. L. 89–800, §1 (b), добавлены положения, касающиеся обращения с имуществом на период приостановления и выборов, которые считаются проведенными в связи с этим.

Подсек. (h) – (k). Паб. L. 89–800, §1 (a), добавлены подпункты. (h) – (j) и переименован в бывшую подпункт. (h) как (k).

1964 — Подсек.(а) (1) (В). Паб. L. 88–272, §203 (c) (2), добавлен подпункт. (С).

Подсек. (г). Паб. L. 88–272, §203 (a) (3) (A), (b), заменено «кроме случаев, предусмотренных в параграфе (2)» на «если такое имущество было построено арендодателем (или корпорацией, которая контролирует или контролируется арендодателем в значении раздела 368 (c)) »в п. (1), «если такая собственность сдается в аренду корпорацией, которая является членом аффилированной группы (в значении раздела 46 (а) (5), другой корпорации, которая является членом той же аффилированной группы» для «если пункт (1) не применяется »в п.(2), и удалил положения, в которых говорилось, что если арендодатель сделал выбор в соответствии с этим подразделом, подраздел (g) не будет применяться в отношении такого имущества, и вычеты, разрешенные в иных случаях в соответствии с разделом 162 для арендатора на суммы, уплаченные арендодателю, будут корректироваться в соответствии с подразделом. (грамм).

Подсек. (грамм). Паб. L. 88–272, §203 (a) (1), отмененный подст. (g) который требовал, чтобы основание раздела 38 собственности было уменьшено на 7 процентов квалифицированных инвестиций.

Раков | Бесплатный полнотекстовый | Обзор роли Wnt в иммуномодуляции рака

2.Wnt Pathways

Wnt пути действуют как критические каскады передачи сигналов, которые модулируют эмбриональное развитие, гомеостаз взрослых, контроль стволовых клеток и заживление ран [5]. Первые белки Wnt были открыты в 1982 г. [6]. В настоящее время известно 19 лигандов Wnt у млекопитающих, состоящих из различных гликопротеинов длиной примерно 350–400 аминокислот, которые являются высококонсервативными у многих видов [7]. Пути, стимулируемые этими лигандами, приводят к изменениям экспрессии генов, которые влияют на цитоскелет и пролиферацию клетки, действуя при этом как факторы направленного роста [8].Из-за этой важной роли в клеточной регуляции изменения в передаче сигналов Wnt, следовательно, могут приводить ко многим заболеваниям человека, от врожденных пороков развития до расстройств нервной системы и злокачественных новообразований, что делает этот путь очень желательной терапевтической мишенью с множества точек зрения. Большая часть направленных на Wnt терапий, находящихся в разработке, сосредоточена на ингибировании Wnt, тогда как другие являются усилителями пути Wnt. Более полное понимание нижестоящих эффектов передачи сигналов Wnt необходимо для оптимальной терапевтической манипуляции.В качестве начального шага в этом сигнальном каскаде лиганды Wnt должны быть обработаны и экспортированы (Рис. 1). Белки Wnt модифицируются присоединением липида, пальмитолеиновой кислоты [9]. Эту модификацию выполняет фермент Porcupine (PORCN), расположенный в эндоплазматическом ретикулуме клетки [9]. Считается, что это добавление липидов способствует привлечению внеклеточной мембраны и действует как связывающий мотив во время взаимодействий лиганд-рецептор [10]. Как только липидное прикрепление завершено, белок Wnt транспортируется к плазматической мембране для секреции [11].Специфические механизмы внеклеточного транспорта Wnt все еще исследуются, но они могут включать в себя секреторные пузырьки или включение экзосом [12].
2.1. Канонический путь
Традиционно пути Wnt связаны со стабилизацией внутриклеточного β-catenin [13]. Накопление β-катенина в цитоплазме делает возможным его ядерную транслокацию, что приводит к усилению регуляции Wnt-чувствительных генов. Сигнальный каскад начинается, когда лиганды Wnt связываются с трансмембранным рецептором Frizzled (Fzd или Fz) и корецепторным белком-5/6, связанным с рецептором липопротеинов низкой плотности (LRP5 / 6) [14] (Figure 1).После этого взаимодействия цитоплазматический хвост LRP рекрутирует Axin. Disheveled (Dvl), белок, который может связываться с Fzd, может действовать как платформа для этого взаимодействия LRP / Axin [5]. Аксин является компонентом комплекса деградации β-катенина. Этот комплекс дополнительно состоит из аденоматозного полипоза кишечной палочки (APC), казеинкиназы 1α (CK1α) и киназы гликогенсинтазы 3β (GSK3β). При правильном функционировании комплекс деградации β-катенина фосфорилирует аминоконцевую область β-катенина. Это вызывает распознавание β-catenin β-Trcp, субъединицей E3 ubiquitin ligase, что приводит к убиквитинированию и протеасомной деградации β-catenin [15,16].Когда комплекс становится неактивным, в цитозоле клетки происходит стабильное накопление β-catenin, достигающее высшей точки в транслокации β-catenin в ядро ​​клетки [17]. Здесь β-катенин может связываться с фактором транскрипции Т-клеточный фактор / лимфоидный энхансер-связывающий фактор (TCF / Lef1), активируя транскрипцию генов-мишеней Wnt [18,19]. Axin2 – это общий ген-мишень транскрипции Wnt, который часто используется в качестве индикатора активации этого пути [20].
2.2. The Noncanonical Pathways
Большинство исследований сосредоточено на роли Wnt в каноническом сигнальном пути; однако Wnt также может передавать сигналы по ряду неканонических путей.Эти пути включают сигнальные пути Wnt-JNK, Wnt-RAP1, Wnt-Ror2, Wnt-PKA, Wnt-GSK3MT, Wnt-aPKC, Wnt-RYK, Wnt-mTOR и Wnt / Ca 2+ . Большинство этих путей перекрываются, чтобы передавать кальций-зависимую клеточную передачу сигналов [21]. Считается, что трансмембранный рецептор Fz также участвует в этих путях, тогда как корецептор LRP5 / 6, как полагают, функционирует только в передаче сигналов канонического пути. Фактически, есть доказательства in vivo, чтобы предположить, что LRP6 может противодействовать неканоническим путям Wnt, возможно, чтобы устранить конкуренцию за лиганды Wnt [22].Ror1 / 2 является корецептором, часто участвующим в неканонических путях. Взаимодействие лиганда с этим корецептором вызывает увеличение инозитолтрифосфата (IP3) и диацилглицерина (DAG). IP3 вызывает высвобождение Ca 2+ из эндоплазматического ретикулума, что приводит к активации протеинкиназы C (PKC). PKC активирует ядерный фактор каппа-B (NFκB) и белок, связывающий элемент ответа цАМФ (CREB). Кальциневрин (Cn) и кальций / кальмодулин-зависимая протеинкиназа типа II (CamKII) также активируются, что приводит к активации ядерного фактора активированных Т-клеток (NFAT) и NFκB.NFκB, CREB и NFAT перемещаются в ядро, вызывая транскрипцию регуляторных генов [21]. Хотя эти многие механизмы могут быть не полностью поняты, ясно, что Wnt участвует в жизненно важных клеточных функциях, таких как помощь в стабилизации белков во время митоза, посредством этих альтернативных путей [23].
2.3. Ингибиторы Wnt
Существует несколько семейств белков и генов, которые, как известно, противодействуют или модулируют передачу сигналов Wnt. DKK1, член семейства белков Dickkopf (DKK), как полагают, действует как антагонист лиганда LRP5 / 6 [24] (Рисунок 1).Существуют разные идеи о механизме этого действия, с подтверждающими доказательствами, что DKK1 может индуцировать интернализацию и деградацию LRP6 или может нарушать Wnt-индуцированный комплекс Fz-LRP6 [25]. Интересно, что хотя считалось, что DKK1 обладает опухолевой супрессивной природой, теперь обнаружено, что он связан с плохим прогнозом, поддерживая рост опухоли и метастазирование [25]. Напротив, иммунное уклонение опухоли с помощью Dickkopf-related protein 2 (DKK2) с LRP5, как полагают, действует независимо от пути Wnt / β-catenin посредством ингибирования передачи сигналов STAT5 [26].Белки склеростина / SOST являются секретируемыми белками, связанными с FZD. Они и белок-ингибитор Wnt также действуют как ингибиторы путем прямого взаимодействия с Wnt [8]. Rnf43 и Znrf3 представляют собой два гена-мишени Wnt, которые действуют как регуляторы отрицательной обратной связи, поскольку они вызывают деградацию рецепторов Wnt [27,28,29]. В целом, роль этих ингибиторов и регуляторов требует дальнейшего изучения, поскольку их способность модулировать аномальный Wnt может быть терапевтически полезной при различных условиях заболевания.

4. Нацеливание на передачу сигналов Wnt как новый терапевтический вариант

Существует множество взаимосвязей между передачей сигналов Wnt, иммунной функцией и прогрессированием рака; наиболее примечателен тот факт, что усиление передачи сигналов Wnt коррелирует со снижением инфильтрации опухолевых Т-клеток, как обсуждалось выше.Пути Wnt выполняют огромное количество ролей, которые предлагают множество вариантов для модуляции пути в злокачественных условиях. В базах данных патентов и патентных заявок Соединенных Штатов Америки сообщается о 103 уникальных модуляторах передачи сигналов Wnt, из которых 34 находятся в клинических испытаниях [101]. Действие этих методов лечения варьируется от нацеленных на активаторы компонента сигнального пути до ингибиторов Wnt. Многие любопытные исследования оценивают иммунитет к опухоли с помощью лекарств. Понимание иммуномодуляции этих методов лечения будет иметь важное значение при попытках перевести TME в менее устойчивую среду.Многочисленные исследования в настоящее время комбинируют терапию Wnt с ICI, дополнительными ингибиторами Wnt или химиотерапией в попытке достичь оптимального эффекта в борьбе с опухолью. Однако в настоящее время неизвестно, как комбинация методов лечения повлияет на прогрессирование опухоли. При раке толстой кишки изменения в путях передачи сигналов Wnt в некоторых исследованиях показали противоречивые результаты, такие как блокада WNT-TCF, фактически усиливающая метастазирование [102]. Напротив, другие результаты предполагают синергизм между ингибированием пути Wnt и ICIs, например, при использовании в качестве комбинаторной терапии на модели меланомы у мышей [103].Было обнаружено, что дополнительные комбинированные методы лечения множественными ингибиторами Wnt возвращают резистентность и подавляют рост опухоли при колоректальном раке [104]. Кроме того, комбинация антагонистов Wnt с таксановой терапией вызвала синергетический эффект за счет сенсибилизации раковых стволовых клеток к индуцированной таксаном гибели [105]. В таблице 1 указаны клинические испытания модуляторов Wnt с указанным агентом, механизмом действия, стратегией вмешательства и целевым заболеванием. Терапевтическая модуляция передачи сигналов Wnt исследуется многими путями, некоторые из которых изображены на Рисунке 1.Один агент, находящийся под следствием, – ДКН-01. Это моноклональное антитело к DKK1, ингибитору Wnt / β-катенина. DKN-01 используется в нескольких клинических испытаниях для изучения безопасности и эффективности у пациентов с несколькими типами первичных опухолей. Было проведено два завершенных клинических испытания этого препарата при множественной миеломе (NCT01711671, NCT01457417). Результаты одного из этих исследований доступны, но опубликованные выводы еще не опубликованы [106]. Высокие сывороточные уровни DKK1 были обнаружены у пациентов с раком поджелудочной железы, желудка, печени, желчных протоков, груди и шейки матки [74].Предыдущие исследования также показали, что увеличение DKK1 стабилизировало популяции MDSC, что приводило к подавлению внутриопухолевого ответа Т-клеток [76]. Прямое влияние на передачу сигналов Wnt от этих агентов является запутанным, поскольку оно является результатом ингибирования ингибитора Wnt. Если этот ингибитор блокирует каноническую передачу сигналов Wnt, это может привести к усилению неканонической передачи сигналов. Возможно, при ингибировании DKK1 альтернативный путь нормализуется. Также может наблюдаться уменьшение внутриопухолевых супрессивных MDSC, что приводит к увеличению распознавания опухолевых клеток и их клиренса Т-клетками CD8 + .Будет интересно посмотреть результаты будущих клинических испытаний, связанных с эффектами на TME, которые возникают после целевого ингибирования ингибитора Wnt, с комбинированной терапией и без нее. Альтернативные терапевтические агенты действуют непосредственно на секрецию лиганда Wnt. Известно, что ингибиторы PORCN блокируют внеклеточную экскрецию Wnt, блокируя фермент, ответственный за пальмитоилирование лигандов Wnt (рис. 1). Это семейство ингибиторов включает C59, CGX 1321, ETC19, LGK974, IWP-L6 и RXC004.С этим общим внеклеточным снижением лигандов Wnt TME может обладать способностью превращаться в среду, воспламененную Т-клетками, на основании доказательств усиленной передачи сигналов Wnt, коррелирующей с опухолями без воспаления Т-клеток [87]. Многие из этих молекул остаются предметом доклинических исследований; тем не менее, некоторые исследования перешли в клинические испытания. Ожидаемые результаты дадут представление об эффективности лечения множественных злокачественных новообразований. Некоторые агенты, изменяющие Wnt, ранее были одобрены для лечения доброкачественных заболеваний.Артесунат – это соединение, извлеченное из травы Artemisia annua, которое используется в качестве противомалярийного препарата, одобренного Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов. Обработка ксенотрансплантатов колоректальной опухоли этим агентом коррелировала со снижением роста опухолей с ингибированием гиперактивного пути Wnt / β-катенин [107]. Точный механизм действия агента остается неизвестным. Однако в настоящее время завершены два испытания фазы 1 с использованием этого агента у субъектов с гепатоцеллюлярной карциномой или солидными опухолями. Ожидаются результаты этих исследований с увеличением дозы (NCT02304289, NCT02353026).В дополнительном завершенном исследовании фазы 1 оценивали артесунат в качестве дополнительной терапии у субъектов с метастатическим или местнораспространенным раком молочной железы, но результаты не опубликованы (NCT00764036). Кроме того, никлозамид является противоглистным агентом, который, как было установлено, имеет множество молекулярных мишеней, включая ингибирование пути Wnt. В частности, взаимодействие Axin-GSK3β нацелено на этот путь, что приводит к подавлению Wnt / Snail [108]. Есть несколько испытаний фазы 1 с участием этого терапевтического агента при различных формах рака.Одно испытание с участием нескольких типов рака простаты было завершено, результаты ожидаются (NCT02532114). Одно предостережение заключается в том, что при таком большом количестве известных мишеней может быть трудно определить, связаны ли эффекты этих методов лечения напрямую с изменениями Wnt в опухоли, а не с дополнительными механистическими изменениями. клинические испытания. Ипафрисепт, также известный как OMP54F28, представляет собой рекомбинантный слитый белок с внеклеточной частью рецептора Fzd 8, присоединенной к фрагменту Fc IgG1, который действует как рецептор-ловушка для лигандов Wnt [109].Четыре испытания фазы 1 были завершены с этой терапией (NCT02069145, NCT020, NCT02050178, NCT01608867). Выводы исследования не опубликованы. WNT5A представляет собой лиганд Wnt, имитирующий Foxy-5, формилированный 6-аминокислотный пептидный фрагмент. Считается, что агент нарушает миграцию эпителиальных раковых клеток, придавая им антиметастатический потенциал [110]. Два клинических испытания были завершены для определения подходящих доз для испытаний фазы 2 (NCT02020291, NCT02655952). Из-за повышенных уровней β-катенина, обнаруживаемых при многих формах рака толстой кишки, исследуется CREB-связывающий белок (CBP) / ингибитор катенина, PRI724 [111].Завершены два клинических испытания фазы 1 с использованием этого ингибитора при раке поджелудочной железы, остром и хроническом миелоидном лейкозе (NCT01764477, NCT01606579). Результаты этих клинических испытаний в настоящее время недоступны. SM08502 представляет собой пероральный биодоступный низкомолекулярный ингибитор, который, как считается, ингибирует экспрессию генов сигнального пути Wnt, но в настоящее время выясняются точные механизмы действия и его связь с Wnt. Одно клиническое испытание фазы 1 использует этот агент для лечения солидных опухолей (NCT03355066).Завершение этих и будущих исследований может дать представление об оптимальной дозе и сроках введения терапевтических средств на основе Wnt и злокачественных новообразований, которые наиболее чувствительны к этим агентам.

5. Выводы

Здесь мы рассмотрели доклинические и клинические данные, которые подтверждают продолжающееся исследование комбинирования модуляторов передачи сигналов Wnt с химиотерапией или иммунотерапией рака для достижения лучшего контроля опухоли у большего процента пациентов. Как обсуждалось, передача сигналов Wnt участвует в регуляции широкого спектра сложных клеточных функций как в злокачественных клетках, так и в лейкоцитах.Более того, аберрации в передаче сигналов Wnt теперь хорошо установлены при множестве злокачественных новообразований, а повышенная передача сигналов Wnt обнаруживает сильную корреляцию с общим иммуносупрессивным действием. Имеются также данные, позволяющие предположить, что продвижение опухолевых стволовых клеток посредством усиленной передачи сигналов Wnt может вносить вклад в уклонение от иммунитета. Таким образом, поиск способов специфического изменения передачи сигналов Wnt в опухолевых клетках и / или опухолевых стволовых клетках может обеспечить платформу для индукции полезных изменений иммунного TME, что приведет к повышению эффективности лечения рака.Агенты, модулирующие Wnt, в клинических испытаниях включают антитела DKK1, ингибиторы PORCN, активаторы AXIN1, ловушки Wnt, имитаторы WNT5A, ингибиторы β-катенина и другие с менее четко определенными механизмами действия. В настоящее время необходимы дополнительные исследования, чтобы более полно понять, как агенты, модулирующие Wnt, изменяют внутриопухолевый иммунный ответ и более широкий TME. Тем не менее, синергетические эффекты, наблюдаемые на сегодняшний день с ICI или химиотерапевтическими препаратами, используемыми в сочетании с ингибиторами Wnt, подтверждают идею о том, что нацеливание на путь Wnt является многообещающим терапевтическим подходом для многих типов опухолей, поскольку это может способствовать защитному противоопухолевому иммунитету и преобразованию опухолевая среда еще раз поддается традиционным методам лечения.

% PDF-1.3 % 1 0 obj> endobj 2 0 obj> endobj 3 0 obj> endobj 4 0 obj >>> / Содержание [85 0 R 86 0 R 87 0 R] / MediaBox [0 -0,01 595,45 842,04] >> endobj 5 0 obj >>> / Содержание [89 0 R 90 0 R 91 0 R] / MediaBox [0 0,01 599,05 844,56] >> endobj 6 0 obj >>> / Аннотации [92 0 R 93 0 R 94 0 R 95 0 R 96 0 R 97 0 R 98 0 R 99 0 R] / Содержание [101 0 R 102 0 R 103 0 R] / MediaBox [0 -0,01 599,4 844,74] >> endobj 7 0 obj >>> / Аннотации [104 0 R 105 0 руб. 106 0 руб. 107 0 R 108 0 R 109 0 R 110 0 R 111 0 R 112 0 R 113 0 R 114 0 R 115 0 R 116 0 R] / Содержание [118 0 R 119 0 R 120 0 R] / MediaBox [0 0.01 601.75 846.36] >> endobj 8 0 obj >>> / Annots [121 0 R 122 0 R 123 0 R 124 0 R 125 0 R 126 0 R 127 0 R 128 0 R 129 0 R 130 0 R 131 0 R 132 0 R] / Содержание [134 0 R 135 0 R 136 0 R] / MediaBox [0 -0,02 599,95 845,28] >> endobj 9 0 obj >>> / Contents [138 0 R 139 0 R 140 0 R] / MediaBox [0 -0,01 601,9 846,54] >> endobj 10 0 obj >>> / Contents [142 0 R 143 0 R 144 0 R] / MediaBox [0 0,01 607,85 850,86] >> endobj 11 0 obj >>> / Contents [146 0 R 147 0 148 руб.] / MediaBox [0 0.02 602.1 846.72] >> endobj 12 0 obj >>> / Contents [150 0 R 151 0 R 152 0 R] / MediaBox [0 -0.01 599.4 844.74] >> endobj 13 0 obj >>> / Contents [154 0 R 155 0 руб. 156 0 R] / MediaBox [0 0,02 603,55 847,62] >> endobj 14 0 obj >>> / Contents [158 0 R 159 0 R 160 0 R] / MediaBox [0 0 598,5 844.2] >> endobj 15 0 obj >> > / Содержание [162 0 R 163 0 R 164 0 R] / MediaBox [0 0,01 601,55 846,36] >> endobj 16 0 obj >>> / Содержание [166 0 R 167 0 R 168 0 R] / MediaBox [0 0,01 604.25 848.16] >> endobj 17 0 obj >>> / Содержание [170 0 R 171 0 R 172 0 R] / MediaBox [0 0 599,75 845.1] >> endobj 18 0 obj >>> / Содержание [174 0 R 175 0 R 176 0 R] / MediaBox [0 0,01 599,05 844,56]> > эндобдж 19 0 obj >>> / Содержание [178 0 R 179 0 R 180 0 R] / MediaBox [0 -0,01 605,7 849,24] >> endobj 20 0 obj >>> / Содержание [182 0 R 183 0 R 184 0 R] / MediaBox [0 -0,01 599,2 844,74 ] >> endobj 21 0 obj >>> / Содержание [186 0 R 187 0 R 188 0 R] / MediaBox [0 0,02 601.9 846.72] >> endobj 22 0 obj >>> / Contents [190 0 R 191 0 R 192 0 R] / MediaBox [0 -0.02 599.95 845.28] >> endobj 23 0 obj >>> / Contents [194 0 R 195 0 R 196 0 R] / MediaBox [0 -0.02 601.2 846.18] >> endobj 24 0 obj >>> / Contents [198 0 R 199 0 200 руб.] / MediaBox [0 0,01 599,05 844,56] >> endobj 25 0 obj >>> / Contents [202 0 R 203 0 R 204 0 R] / MediaBox [0 -0,02 599,95 845,28] >> endobj 26 0 obj >>> / Contents [206 0 207 руб. 0 руб. 208 0 R] / MediaBox [0 -0.02 600.1 845.28] >> endobj 27 0 obj >>> / Contents [210 0 R 211 0 R 212 0 R] / MediaBox [0 0 597.25 843.3] >> endobj 28 0 obj >>> / Contents [214 0 R 215 0 R 216 0 R] / MediaBox [0 -0,01 597,95 843,84] >> endobj 29 0 obj >>> / Contents [218 0 R 219 0 R 220 0 R] / MediaBox [0 0 599,75 845,1] >> endobj 30 0 объект >>> / Содержание [222 0 R 223 0 R 224 0 R] / MediaBox [0 -0,01 599,2 844,74] >> endobj 31 0 obj >>> / Содержание [226 0 R 227 0 R 228 0 R] / MediaBox [0 -0,01 599.4 844.74] >> endobj 32 0 obj >>> / Содержание [230 0 R 231 0 R 232 0 R] / MediaBox [0 0,02 597,05 843,12] >> endobj 33 0 obj >>> / Содержание [234 0 R 235 0 R 236 0 R] / MediaBox [0 0,01 598,85 844,56] >> endobj 34 0 obj >>> / Contents [238 0 R 239 0 R 240 0 R] / MediaBox [0 -0,01 599,2 844,74] >> endobj 35 0 obj >>> / Contents [242 0 R 243 0 R 244 0 R] / MediaBox [0 -0,02 597,4 843,48] >> endobj 36 0 obj >>> / Contents [246 0 R 247 0 R 248 0 R] / MediaBox [0 -0,02 597.6 843.48] >> endobj 37 0 obj >>> / Содержание [250 0 R 251 0 R 252 0 R] / MediaBox [0 -0,02 602,45 847,08] >> endobj 38 0 obj >>> / Contents [254 0 R 255 0 R 256 0 R] / MediaBox [0 -0,02 598,7 844,38] >> endobj 39 0 obj >>> / Contents [ 258 0 руб. 259 0 руб. 260 0 R] / MediaBox [0 0,02 598,15 844,02] >> endobj 40 0 ​​obj >>> / Contents [262 0 R 263 0 R 264 0 R] / MediaBox [0 -0,01 600,5 845,64] >> endobj 41 0 obj >>> / Содержание [266 0 R 267 0 руб. 268 0 руб.] / MediaBox [0 0,01 600.3 845.46] >> endobj 42 0 obj >>> / Contents [270 0 R 271 0 R 272 0 R] / MediaBox [0 0,01 600,1 845.46] >> endobj 43 0 obj >>> / Содержание [274 0 R 275 0 R 276 0 R] / MediaBox [0 0 606,05 849,6] >> endobj 44 0 obj >>> / Содержание [278 0 R 279 0 R 280 0 R] / MediaBox [0 -0,01 599,4 844,74] >> endobj 45 0 obj >>> / Содержание [282 0 R 283 0 R 284 0 R] / MediaBox [0 -0,01 603 847,44] >> endobj 46 0 obj >>> / Содержание [286 0 R 287 0 R 288 0 R] / MediaBox [0 -0,02 602,65 847 .08] >> endobj 47 0 obj >>> / Contents [290 0 R 291 0 R 292 0 R] / MediaBox [0 0,01 602,8 847,26] >> endobj 48 0 obj >>> / Contents [294 0 R 295 0 R 296 0 R] / MediaBox [0 -0,01 599,4 844,74] >> endobj 49 0 obj >>> / Contents [298 0 R 299 0 R 300 0 R] / MediaBox [0 -0,02 599,95 845,28] >> endobj 50 0 obj >>> / Contents [302 0 R 303 0 R 304 0 R] / MediaBox [0 0 599.75 845.1] >> endobj 51 0 obj >>> / Contents [306 0 R 307 0 R 308 0 R] / MediaBox [0 -0,01 603,2 847.44] >> endobj 52 0 obj >>> / Содержание [310 0 R 311 0 R 312 0 R] / MediaBox [0 -0,02 600,1 845,28] >> endobj 53 0 obj >>> / Contents [314 0 R 315 0 R 316 0 R] / MediaBox [0 0 598,5 844.2] >> endobj 54 0 obj> >> / Содержание [318 0 R 319 0 R 320 0 R] / MediaBox [0 0,02 602,1 846,72] >> endobj 55 0 obj >>> / Содержание [322 0 R 323 0 R 324 0 R] / MediaBox [0 0,01 601,75 846,36] >> endobj 56 0 obj >>> / Содержание [326 0 R 327 0 R 328 0 R] / MediaBox [0 0,01 599,05 844,56] >> endobj 57 0 obj >>> / Содержание [330 0 R 331 0 R 332 0 R] / MediaBox [0 0 602.45 846,9] >> endobj 58 0 obj> >> / Contents [334 0 R 335 0 R 336 0 R] / MediaBox [0 0,02 599,4 844,92] >> endobj 59 0 obj >>> / Contents [338 0 R 339 0 R 340 0 R] / MediaBox [0 0 601,2 846] >> endobj 60 0 obj >>> / Contents [342 0 R 343 0 R 344 0 R] / MediaBox [0 0,01 597,8 843,66] >> endobj 61 0 obj >>> / Contents [346 0 R 347 0 R 348 0 R] / MediaBox [0 0,02 600,85 845,82] >> endobj 62 0 obj >>> / Содержание [350 0 R 351 0 R 352 0 R] / MediaBox [0 0,02 599,6 844.92] >> endobj 63 0 obj >>> / Содержание [354 0 R 355 0 R 356 0 R] / MediaBox [0 0,02 598,15 844,02] >> endobj 64 0 obj >>> / Contents [358 0 R 359 0 R 360 0 R] / MediaBox [0 0 602,3 846.9] >> endobj 65 0 obj >>> / Contents [362 0 363 0 R 364 0 R] / MediaBox [0 0,02 598,3 844,02] >> endobj 66 0 obj >>> / Contents [366 0 R 367 0 R 368 0 R] / MediaBox [0 -0,01 597,95 843,84] >> endobj 67 0 obj >>> / Contents [370 0 руб. 371 0 руб. 372 0 R] / MediaBox [0 0,02 596,9 843.12] >> endobj 68 0 obj >>> / Contents [374 0 R 375 0 R 376 0 R] / MediaBox [0 0,02 600,85 845,82] >> endobj 69 0 obj >>> / Содержание [378 0 R 379 0 R 380 0 R] / MediaBox [0 0 599.75 845.1] >> endobj 70 0 obj >>> / Contents [382 0 R 383 0 R 384 0 R] / MediaBox [0 0,02 598,15 844,02] >> endobj 71 0 объект >>> / Содержание [386 0 R 387 0 R 388 0 R] / MediaBox [0 -0,01 597,95 843,84] >> endobj 72 0 obj >>> / Содержание [390 0 R 391 0 R 392 0 R] / MediaBox [0 -0,01 597,95 843.84] >> endobj 73 0 obj >>> / Содержание [394 0 R 395 0 R 396 0 R] / MediaBox [0 0,02 598,3 844,02] >> endobj 74 0 obj >>> / Содержание [398 0 399 0 R 400 0 R] / MediaBox [0 -0,01 599,2 844,74] >> endobj 75 0 obj >>> / Contents [402 0 R 403 0 R 404 0 R] / MediaBox [0 0,02 599,6 844,92] >> endobj 76 0 obj >>> / Contents [406 0 R 407 0 R 408 0 R] / MediaBox [0 0,02 599,4 844,92] >> endobj 77 0 obj >>> / Содержание [410 0 R 411 0 R 412 0 R] / MediaBox [0 0,02 599,4 844.92] >> endobj 78 0 obj >>> / Содержание [414 0 R 415 0 R 416 0 R] / MediaBox [0 -0,02 597,4 843,48] >> endobj 79 0 obj >>> / Contents [418 0 R 419 0 R 420 0 R] / MediaBox [0 -0,01 595,45 842,04] >> endobj 80 0 obj >>> / Contents [ 422 0 руб. 423 0 руб. 424 0 R] / MediaBox [0 -0,01 597,95 843,84] >> endobj 81 0 obj >>> / Contents [426 0 R 427 0 R 428 0 R] / MediaBox [0 -0,01 595,45 842,04] >> endobj 82 0 obj >>> / Содержание [430 0 R 431 0 R 432 0 R] / MediaBox [0 0,02 599.6 844.92] >> endobj 83 0 obj> endobj 84 0 obj> stream

мультиплексная платформа для цифрового измерения продуктов кольцевой ДНК-реакции | Исследование нуклеиновых кислот

Аннотация

Цифровая ПЦР

обеспечивает высокую чувствительность и беспрецедентную точность количественного определения ДНК, но современные подходы требуют специального оборудования и имеют ограниченные возможности для мультиплексирования. Здесь мы представляем изотермическую платформу для цифрового подсчета продуктов реакции ДНК в мультиплексе с помощью стандартной флуоресцентной микроскопии.Кольцевые цепи ДНК, которые могут возникать в результате широкого диапазона реакций молекулярного обнаружения, захватываются на покрытых стрептавидином поверхностях с помощью гибридизированных биотинилированных праймеров с последующей амплификацией по методу катящегося круга (RCA). Добавление 15% полиэтиленгликоля 4000 во время RCA привело к однородным, легко регистрируемым продуктам реакции. Круги иммобилизованной ДНК визуализировали как продукты RCA со 100% эффективностью, как определено с помощью цифровой ПЦР по каплям. Мы подтвердили предыдущие сообщения о влиянии на RCA составом последовательности и размером шаблонов RCA, и мы разработали эффективную одноэтапную процедуру восстановления для последовательного мультиплексирования с использованием смещения нити ДНК, запускаемого зацеплением.Наконец, мы приводим примеры применения этой платформы цифрового считывания, демонстрируя более чем на три порядка улучшенную чувствительность с помощью цифрового измерения простатического специфического антигена (ПСА) (порог обнаружения ∼100 пг / л) по сравнению с коммерческим иммуноферментным анализом ( ELISA) с аналоговым считыванием (порог обнаружения ~ 500 нг / л) с использованием той же пары антител.

ВВЕДЕНИЕ

Возрастает потребность в цифровом подсчете индивидуальных биомолекул и молекулярных событий в качестве чувствительного и точного средства для количественной оценки характеристик биологических образцов.Кроме того, растущее понимание сложности заболевания создает потребность в высоко мультиплексных измерениях многих биомаркеров одного или нескольких молекулярных классов. Цифровая ПЦР (dPCR) предлагает беспрецедентную точность для подсчета отдельных молекул ДНК в образце (1), и этот метод все больше заменяет аналоговые измерения фракционного цикла, когда заданный уровень флуоресценции превышается в ПЦР в реальном времени или еще раньше. оценка количества конечных продуктов ПЦР с помощью гель-электрофореза.Однако dPCR страдает такими ограничениями, как необходимость в специальных приборах, высокая стоимость, низкое мультиплексирование и ограниченный динамический диапазон.

Амплификация по методу катящегося круга (RCA) – это эффективный метод локальной амплификации отдельных кольцевых молекул ДНК до легко определяемых уровней. Этот метод служит для создания различных объектов размером в мкм – продуктов катящегося круга (RCP), каждый из которых содержит сотни или более копий дополнения каждого шаблонного круга ДНК (2). После специфического окрашивания олигонуклеотидами ДНК, конъюгированными с флуорофором, отдельные RCP можно визуализировать и отличить от фона в виде ярких точек с помощью флуоресцентной микроскопии и компьютерного анализа изображений, что позволяет производить цифровой подсчет продуктов репортерных кругов ДНК в качестве результата реакций молекулярного обнаружения, которые производят круги ДНК.

Примеры реагентов для обнаружения, которые генерируют кольцевые репортерные молекулы, включают зонды с замком для высокоспецифичного, мультиплексного обнаружения ДНК (3,4) и анализы белков, проводимые либо с помощью иммуно-RCA (5,6), либо с помощью in situ тестов лигирования близости ( isPLA) (7,8). В этих белковых анализах используются реагенты для обнаружения, которые либо снабжены предварительно сформированными кругами ДНК для иммуноРКА, либо в которых круги ДНК образуются при проксимальном связывании парами антител в isPLA. RCP могут быть созданы в растворе и распределены на поверхности для подсчета (9,10), или цели могут быть расположены на опоре, например, для анализов на месте .В других анализах продукты кольцевой реакции ДНК, образующиеся в растворе, могут быть захвачены на твердых носителях перед RCA (11). Образование или захват кругов ДНК на подложках допускает промывки, которые обеспечивают оптимальные условия RCA путем удаления ингибирующих компонентов образца и / или избыточных реагентов.

Полиэтиленгликоль (ПЭГ), как ранее было показано, влияет на эффективность RCA на магнитных шариках (12). Также сообщалось, что размер и состав последовательности круглых шаблонов влияют на эффективность RCA, выполняемого в растворе (13,14).Здесь мы оптимизировали RCA на предметных стеклах, покрытых стрептавидином. Мы оценили такие аспекты, как влияние на эффективность RCA добавления PEG, а также по размеру круглой матрицы и составу последовательностей с некоторыми подробностями. Наши оптимизированные условия реакции были применены для цифрового обнаружения ПСА в анализе, который на три порядка превышал чувствительность обнаружения коммерческого ELISA с использованием той же пары антител.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Рабочий процесс

Настоящий метод обнаружения ДНК состоит из следующих этапов: создание кольцевых цепей ДНК, иммобилизация кругов ДНК на плоской подложке и RCA с последующим окрашиванием и визуализацией с анализом данных (рис. 1).Окрашивание и визуализацию можно повторить несколько раз для достижения желаемой степени мультиплексирования. Обесцвечивание сочетается с окрашиванием новых наборов RCP за одну стадию реакции.

Рисунок 1.

Рабочий процесс для цифрового обнаружения RCP. Во-первых, молекулярный анализ приводит к образованию кругов ДНК в ответ на присутствие целевых молекул (циркуляризация), и образованные круги ДНК захватываются, гибридизуются с биотинилированными праймерами на предметном стекле микроскопа, покрытом стрептавидином (иммобилизация).Затем RCA используется для удлинения иммобилизованных праймеров с кругами ДНК в качестве матриц, в результате чего длинные конкатемерные молекулы ДНК схлопываются в отдельные пучки ДНК (амплификация с вращающимся кругом – RCA). Следующим шагом (который может выполняться одновременно с предыдущим) является окрашивание RCP детектирующими олигонуклеотидами, конъюгированными с флуорофорами (окрашивание), с последующей регистрацией количества ярких RCP с помощью флуоресцентной микроскопии (визуализация). Наконец, программное обеспечение для анализа изображений используется для цифрового подсчета количества RCP в каждом изображении и канале флуоресценции (анализ изображения) с последующей обработкой полученных данных с помощью программного обеспечения для статистики (анализ данных).Шаги окрашивания и визуализации можно повторять несколько раз для последовательного мультиплексирования. В этом случае смещение нити ДНК, опосредованное пальцами ног, использовалось для одновременного обесцвечивания ранее отображаемых RCP с одновременным окрашиванием новых RCP, подлежащих отображению.

Рисунок 1.

Рабочий процесс для цифрового обнаружения RCP. Во-первых, молекулярный анализ приводит к образованию кругов ДНК в ответ на присутствие целевых молекул (циркуляризация), и образованные круги ДНК захватываются, гибридизуются с биотинилированными праймерами на предметном стекле микроскопа, покрытом стрептавидином (иммобилизация).Затем RCA используется для удлинения иммобилизованных праймеров с кругами ДНК в качестве матриц, в результате чего длинные конкатемерные молекулы ДНК схлопываются в отдельные пучки ДНК (амплификация с вращающимся кругом – RCA). Следующим шагом (который может выполняться одновременно с предыдущим) является окрашивание RCP детектирующими олигонуклеотидами, конъюгированными с флуорофорами (окрашивание), с последующей регистрацией количества ярких RCP с помощью флуоресцентной микроскопии (визуализация). Наконец, программное обеспечение для анализа изображений используется для цифрового подсчета количества RCP в каждом изображении и канале флуоресценции (анализ изображения) с последующей обработкой полученных данных с помощью программного обеспечения для статистики (анализ данных).Шаги окрашивания и визуализации можно повторять несколько раз для последовательного мультиплексирования. В этом случае смещение нити ДНК, опосредованное пальцами ног, использовалось для одновременного обесцвечивания ранее отображаемых RCP с одновременным окрашиванием новых RCP, подлежащих отображению.

Циркуляризация

Циркуляризация ДНК

обычно является следствием реакций обнаружения целевых нуклеиновых кислот или белков, но во время разработки этой процедуры считывания синтетические 5′-биотинилированные цепи ДНК использовались для шаблонной циркуляризации линейных зондов с замком.Нити матрицы были сконструированы так, чтобы гибридизоваться по крайней мере с 10 нуклеотидами как на 3 ‘, так и на 5’-концах зондов с замком, чтобы обеспечить эффективную циркуляризацию. Последовательности всех используемых олигонуклеотидов задокументированы в таблице 1. Лигирование обычно выполняли путем смешивания целевых молекул и биотинилированных матриц лигирования при 100 нМ каждая в 100 мкл реакционной смеси, содержащей 1 × буфер ДНК-лигазы Т4, 1 мМ АТФ и 4 единицы ДНК-лигазы Т4. (все от Thermo Fisher Scientific, США). Смесь для лигирования инкубировали при комнатной температуре в течение 90 мин, чтобы обеспечить эффективную циркуляризацию.Чтобы оценить процесс лигирования с помощью гель-электрофореза, 8,5 мкл реакции лигирования в виде круга смешивали с 0,5 мкл каждого из экзонуклеазы I (20 ед. / Мкл), экзонуклеазы III (200 ед. / Мкл) и экзонуклеазы лямбда (10 ед. / Мкл) (все от Thermo Fisher Scientific, США) и инкубировали при 37 ° C в течение 60 минут и 95 ° C в течение 10 минут (дополнительные рисунки S4 и S7) для удаления любых оставшихся линейных олигонуклеотидов. Циркуляризованные молекулы-мишени хранили замороженными при высокой концентрации и разбавляли непосредственно перед иммобилизацией. Никакой потери исходного материала кольцевой ДНК не наблюдалось во время многих циклов замораживания-оттаивания.Денатурирующий электрофорез в полиакриламидном геле использовали для проверки эффективности циркуляризации (дополнительные рисунки S4 и S7). Использовали гелевую систему Novex ™ TBE Urea (Thermo Fisher Scientific, США) с 10% гелями. Для обеспечения денатурирующих условий при повышенной температуре кассету с гелем частично погружали в водяную баню при 45 ° C во время электрофореза. 10 мкл образца загружали на лунку (5 мкл образца и 5 мкл загрузочного буфера мочевины 2 × TBE), и гель запускали при 180 В в течение 30 минут перед окрашиванием 1 × SYBR Gold в течение 15 минут и визуализацией с помощью Bio-Rad. Система ChemiDoc XRS + (Bio-Rad Laboratories, США).

Таблица 1.

Используемые олигонуклеотиды можно разделить на три отдельные категории в зависимости от специфичности обнаружения (системы A, B и C). Раскраска, используемая в последовательностях, представляет собой обратные комплементарные части. Буква «N» в последовательностях представляет собой случайный нуклеотид (A, T, C или G), и, следовательно, эти олигонуклеотиды представляют собой пулы различных последовательностей

Таблица 1.

Используемые олигонуклеотиды можно разделить на три отдельные категории в зависимости от специфичности обнаружения (системы A, B и C). Раскраска, используемая в последовательностях, представляет собой обратные комплементарные части. Буква «N» в последовательностях представляет собой случайный нуклеотид (A, T, C или G), и, следовательно, эти олигонуклеотиды представляют собой пулы различных последовательностей

5

Иммобилизация

кругов ДНК иммобилизовали на поверхностях, покрытых стрептавидином, с помощью гибридизированных биотинилированных олигонуклеотидов, которые также служили праймерами для RCA.Клейкие камеры FlexWell ™ с шестнадцатью лунками (Grace Bio-labs, США) прикрепляли к покрытым стрептавидином предметным стеклам для микроскопов TRIDIA BA (SurModics IVD Inc., США) и добавляли 40 мкл / лунку ДНК-кружков и праймеров для связывания. & Промывочный буфер, состоящий из 5 мМ Трис (pH 7,5), 0,5 мМ EDTA, 0,05% (об. / Об.) Tween20 и 1 M NaCl. Камеры закрывали липкой пленкой для ПЦР и помещали в камеры влажности (пластиковые коробки с деионизированной водой и штатив для поддержки предметного стекла) в инкубатор при 37 ° C на 2 часа.После иммобилизации камеры дважды быстро промывали 100 мкл / лунку буфера для связывания и промывки, прежде чем приступить к RCA. В альтернативном подходе иммобилизацию путем сушки исследовали путем добавления 1 мкл 1 мкМ кольцевых матриц и праймеров в PBS или в PBS с 0,05% Tween20 (PBST) или в PBST с добавлением 15% PEG 4000 на предметное стекло микроскопа, покрытое стрептавидином. с последующей инкубацией в течение нескольких минут в инкубаторе 45 ° C. После полного высыхания вокруг высушенных участков устанавливали реакционные камеры.Эффективность захвата кругов ДНК и обнаружения RCP для кругов, высушенных в PBST с добавлением PEG, была рассчитана на основе теоретического количества нанесенных кругов, диаметра всей высушенной области, размера одного изображения, среднего количества RCP. на одном изображении, предполагая, что RCP были распределены равномерно.

RCA

RCA выполняли путем добавления 40 мкл / лунку реакционной смеси, содержащей реакционный буфер ДНК-полимеразы Phi29 (Monserate Biotechnology Group, США), 0.25 мМ dNTP (Thermo Fisher Scientific), 8 единиц ДНК-полимеразы Phi29 (Monserate Biotechnology Group, США) и 15% PEG 4000 (Thermo Fisher Scientific), если не указано иное. Камеры закрывали липкой пленкой для ПЦР и помещали во влажную камеру в инкубатор при 37 ° C на 2 часа. После иммобилизации камеры дважды быстро промывали 100 мкл / лунку буфера для связывания и промывки перед тем, как приступить к окрашиванию. Титрование ПЭГ было проанализировано в нескольких экспериментах, последовательно определяющих 15% как оптимальную концентрацию.

Окрашивание

Окрашивание выполняли путем добавления 40 мкл / лунку окрашивающего раствора, содержащего буфер для связывания и промывки, 10% декстрансульфат (50% раствор от Millipore, США) и 100 нМ детектирующего олигонуклеотида. Предметные стекла инкубировали в течение 10 минут в инкубаторе 37 ° C без герметизации, перед удалением инкубационной камеры, дважды промывали в течение пяти минут в буфере для связывания и промывки в кювете на шейкере, установленном на низкую скорость, быстрое обезвоживание в этаноле. серии и монтажа с монтажной средой SlowFadeGold (Thermo Fisher Scientific).

Изображения

Визуализацию выполняли с помощью микроскопа Zeiss Imager Z2, оснащенного цифровой камерой Hamamatsu ORCA-flash5.0 LT, с использованием объектива 20x и ручной фокусировки в режиме реального времени. Из каждой лунки были получены три неперекрывающихся изображения, которые использовались для получения данных. Время экспозиции находилось в диапазоне 0,5–2 с для разных каналов флуоресценции. Условия визуализации оставались постоянными для каждого канала флуоресценции в каждом эксперименте и тщательно регулировались, чтобы не включать передержанные области.Перед анализом изображений и извлечением данных с помощью программного обеспечения CellProfiler корректировки изображений не производились (15). Яркость и контраст были отрегулированы для визуализации на рисунках, но оставались постоянными в каждом эксперименте.

Анализ изображений

Определение характеристик RCP и измерения различных изображений были выполнены с использованием программного обеспечения CellProfiler (15). Между разными экспериментами были сделаны небольшие изменения в настройках конвейера.Типичный конвейер включает пять различных модулей для идентификации и измерения RCP на отдельных изображениях и экспорта полученных данных в электронную таблицу (дополнительный рисунок S3). В каждом эксперименте настройки оставались неизменными, за одним исключением; образцы без ПЭГ во время RCA были проанализированы с использованием более низкого порога для идентификации RCP (0,01 по сравнению с 0,05) и без метода проведения разделительных линий между сгруппированными объектами по сравнению с образцами с ПЭГ. Это несоответствие было связано с большой разницей в интенсивности и форме RCP в этих выборках.Точные настройки, используемые для каждого эксперимента, были тщательно отрегулированы с использованием тестового режима для ручной проверки результатов работы программного обеспечения.

Анализ данных

Все данные были проанализированы в R Studio версии 1.0.143. Распределение яркости RCP для различных типов образцов на Рисунке 2 было рассчитано как отношение между интенсивностью RCP и площадью. Отдельные точки на графиках распределения были распределены по оси x с использованием функции нормального распределения и наложены на графики скрипки (пакет vioplot) и линии, указывающие средние значения яркости.Входные концентрации кругов ДНК и измеренный выход ампликонов из анализа dPCR (молекулы / мкл) были нанесены на логарифмические диаграммы разброса вместе с линией линейной регрессии, основанной на логарифмических значениях (рис. 3A). Количество молекул, обнаруженных при визуализации, было рассчитано на основе соотношения между размером каждого изображения и общей площадью лунки, предполагая, что сигналы были равномерно распределены по каждой лунке (Рисунок 3B). Серая линия на рисунке 5A – это линия регрессии, основанная на среднем количестве RCP на изображение для концентраций от 6 фМ до 4 пМ.На рисунке 5C серая линия представляет среднее количество RCP на изображение для всех выборок, кроме 1:10 5 .

Рисунок 2.

Условия для эффективного RCA были исследованы путем записи количества обнаруженных сигналов и яркости отдельных RCP. Каждая точка на графиках представляет яркость отдельного RCP (рассчитывается как соотношение между интенсивностью и площадью). Для каждого исследуемого условия точки на графиках были распределены по оси x в соответствии с нормальным распределением.Перекрывающиеся точки отображаются все более темным цветом. Распределения наложены графиками скрипки, а средняя яркость указана горизонтальными линиями. Эффективность также была исследована посредством визуальной интерпретации микроскопических изображений с повышенной яркостью и контрастом. ( A ) Эффективность RCA оценивали при увеличивающихся концентрациях добавленного PEG 4000. Количество RCP, записанных на трех изображениях, проанализированных для каждой пробы, отображается вверху.( B ) Сравнивали RCP, полученные из кольцевых матриц четырех разных размеров (63, 68, 73 или 79 нуклеотидов). Круглые матрицы ДНК из 68 и 79 нуклеотидов давали более яркие RCP по сравнению с 63 и 73 нуклеотидными кругами. ( C ) 68 нуклеотидных кольцевых матриц с различным составом последовательностей анализировали в отношении яркости RCP. Круглые шаблоны с высоким содержанием цитидина и аденозина генерировали более яркие RCP, которые были более равномерными по интенсивности, по сравнению с библиотекой со случайными последовательностями и последовательностями с самокомплементарными палиндромными элементами.

Рисунок 2.

Условия для эффективного RCA были исследованы путем регистрации количества обнаруженных сигналов и яркости отдельных RCP. Каждая точка на графиках представляет яркость отдельного RCP (рассчитывается как соотношение между интенсивностью и площадью). Для каждого исследуемого условия точки на графиках были распределены по оси x в соответствии с нормальным распределением. Перекрывающиеся точки отображаются все более темным цветом. Распределения наложены графиками скрипки, а средняя яркость указана горизонтальными линиями.Эффективность также была исследована посредством визуальной интерпретации микроскопических изображений с повышенной яркостью и контрастом. ( A ) Эффективность RCA оценивали при увеличивающихся концентрациях добавленного PEG 4000. Количество RCP, записанных на трех изображениях, проанализированных для каждой пробы, отображается вверху. ( B ) Сравнивали RCP, полученные из кольцевых матриц четырех разных размеров (63, 68, 73 или 79 нуклеотидов). Круглые матрицы ДНК из 68 и 79 нуклеотидов давали более яркие RCP по сравнению с 63 и 73 нуклеотидными кругами.( C ) 68 нуклеотидных кольцевых матриц с различным составом последовательностей анализировали в отношении яркости RCP. Круглые шаблоны с высоким содержанием цитидина и аденозина генерировали более яркие RCP, которые были более равномерными по интенсивности, по сравнению с библиотекой со случайными последовательностями и последовательностями с самокомплементарными палиндромными элементами.

Рисунок 3.

dPCR использовали для оценки эффективности захвата кольцевых молекул ДНК на твердой подложке и их локальной амплификации с помощью RCA.( A ) Серия 10-кратных разведений, проанализированная в трех повторностях, продемонстрировала превосходную линейность (черная линия представляет логарифмическую линейную регрессию). Количество круглых шаблонов, добавленных к твердой подложке (исходная), и тех, которые остались в растворе после иммобилизации (несвязанные), находились в пределах линейного диапазона (красные и синие пунктирные линии). ( B ) Разницу между добавленными молекулами и молекулами, оставшимися в растворе, использовали как меру количества круглых шаблонов, иммобилизованных на твердой подложке (чуть более 50%).Подсчет с помощью RCA и визуализация продемонстрировали, что все иммобилизованные круглые шаблоны (светло-серая полоса, определенная с помощью dPCR) привели к появлению RCP, которые можно было зарегистрировать, о чем свидетельствуют одинаковые высоты светлых и темно-серых полос. ( C ) праймеры dPCR были сконструированы для получения ампликона над сайтом лигирования, так что любые оставшиеся нециркуляризованные олигонуклеотиды не будут амплифицироваться. Специфичность цПЦР для кольцевых матриц была подтверждена путем анализа серии разведений лигированных и нелегированных кольцевых шаблонов.Только циркулярные молекулы генерировали эффективную амплификацию ПЦР и, следовательно, положительные капли.

Рисунок 3.

dPCR использовали для оценки эффективности захвата кольцевых молекул ДНК на твердой подложке и их локальной амплификации с помощью RCA. ( A ) Серия 10-кратных разведений, проанализированная в трех повторностях, продемонстрировала превосходную линейность (черная линия представляет логарифмическую линейную регрессию). Количество круглых шаблонов, добавленных к твердой подложке (исходная), и тех, которые остались в растворе после иммобилизации (несвязанные), находились в пределах линейного диапазона (красные и синие пунктирные линии).( B ) Разницу между добавленными молекулами и молекулами, оставшимися в растворе, использовали как меру количества круглых шаблонов, иммобилизованных на твердой подложке (чуть более 50%). Подсчет с помощью RCA и визуализация продемонстрировали, что все иммобилизованные круглые шаблоны (светло-серая полоса, определенная с помощью dPCR) привели к появлению RCP, которые можно было зарегистрировать, о чем свидетельствуют одинаковые высоты светлых и темно-серых полос. ( C ) праймеры dPCR были сконструированы для получения ампликона над сайтом лигирования, так что любые оставшиеся нециркуляризованные олигонуклеотиды не будут амплифицироваться.Специфичность цПЦР для кольцевых матриц была подтверждена путем анализа серии разведений лигированных и нелегированных кольцевых шаблонов. Только циркулярные молекулы генерировали эффективную амплификацию ПЦР и, следовательно, положительные капли.

Олигонуклеотиды

Все олигонуклеотиды были приобретены в Integrated DNA Technologies (IDT (таблица). Олигонуклеотиды были разделены на три различные системы (A, B и C) на основании их специфичности в отношении циркуляризации и детектирования последовательностей.Олигонуклеотиды из системы A использовали для оценки влияния на эффективность RCA в соответствии с концентрациями PEG, длиной круга и составом последовательности круга. Также динамический диапазон и эффективность иммобилизации и обнаружения (как определено с помощью dPCR) оценивали с использованием системы A. Олигонуклеотиды системы B использовали для сравнения эффектов на RCA со стороны PEG и так называемых олигонуклеотидов уплотнения, предназначенных для конденсации RCP (16). Комбинацию систем A и B использовали для оценки ингибирования насыщением и для демонстрации последовательного мультиплексирования.Олигонуклеотиды из системы C использовали для измерения PSA с помощью цифрового иммуно-RCA.

dPCR

Анализ dPCR выполняли с использованием системы QX200 ™ AutoDG ™ и EvaGreen Supermix (Bio-Rad, США) в соответствии с инструкциями производителя. Порог интенсивности флуоресценции для положительных капель был установлен вручную, и один и тот же порог использовался для всех образцов (рис. 3C). Цепи цПЦР были повторены дважды с очень похожими результатами.

Последовательное мультиплексирование

RCP, происходящие из различных кругов ДНК, были последовательно идентифицированы путем повторения этапов окрашивания и визуализации для изображения последовательных наборов RCP для множественного обнаружения (рис. 1).Чтобы удалить детектирующие олигонуклеотиды из ранее визуализированных RCP, были добавлены специфические замещающие олигонуклеотиды вместе с флуоресцентно-меченными детектирующими олигонуклеотидами для нового набора RCP. Замещающие олигонуклеотиды были полностью комплементарны предыдущим наборам детектирующих олигонуклеотидов, включая 10-нуклеотидную основную область, которая не была комплементарной RCP. Гибридизация до опоры инициировала процесс замещения цепи (17,18), который служил для удаления детектирующих олигонуклеотидов из ранее отображенных RCP.Таким образом, избыток новых детектирующих олигонуклеотидов, а также двухцепочечных детектирующих олигонуклеотидов из более раннего цикла визуализации может быть удален промыванием.

Для демонстрации последовательного мультиплексирования окрашивания и замещения растворы готовили с 100 нМ детектирующего олигонуклеотида и 500 нМ замещающего олигонуклеотида. Этот комбинированный раствор для обесцвечивания и окрашивания добавляли непосредственно на небольшие участки на предметных стеклах, обозначенные гидрофобной барьерной ручкой ImmEDGE ™ (Vector Laboratories, Великобритания).Срезы инкубировали в течение 8 мин в инкубаторе 37 ° C и дважды промывали в течение 1 мин в буфере для связывания и промывки в кювете на шейкере на низкой скорости. В случае последовательного мультиплексирования обезвоживание слайдов не проводилось. Вместо этого на слайды перед визуализацией добавляли несколько капель буфера для связывания и промывки и покровных стекол. Чтобы удалить покровные стекла для последующих циклов окрашивания, слайды погружали в буфер для связывания и промывки. При использовании этого протокола каждая процедура одноэтапного обесцвечивания и нового окрашивания занимала около 10 минут.Процедура повторялась несколько раз, слегка меняя условия в процессе оптимизации.

Сравнение 96-луночного ридера для планшетов

Чтобы сравнить цифровые и аналоговые измерения RCP, мы покрыли микропланшет (культура клеток, 96 лунок, половина площади PS, μ-clear, Black Advanced TC; Greiner Bio-One) с 200 нМ рекомбинантным стрептавидином (Roche), разведенным в буфере для покрытия (бикарбонат / карбонат 100 мМ, pH 9,6) и инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре. Затем раствор для покрытия удаляли и лунки промывали PBS.Серию разведений от 100 мкМ до 100 мкМ кругов ДНК, гибридизованных с биотинилированными праймерами, готовили в двух экземплярах в буфере для связывания и промывки. Иммобилизацию, RCA и окрашивание проводили, как описано выше, с использованием объемов 100 мкл на лунку. Промывки выполняли 200 мкл буфера для связывания и промывки.

Планшетный ридер Tecan Spark использовался для аналогового считывания, выбора монохроматического сбора данных (575–620 нм; ширина полосы 20 нм) и считывания дна флуоресценции. Цифровое считывание производилось на инвертированном световом микроскопе Leica DMi8 с использованием 20-кратного сухого объектива (0.75.dry UV HC, PL APO CS2) и набор фильтров для TexasRed. Время экспозиции и условия визуализации оставались постоянными. Изображения были экспортированы в формат TIFF и проанализированы с помощью CellProfiler.

Весь этот эксперимент был проведен дважды с очень похожими результатами.

Оценка связывающей способности

Чтобы оценить, какое общее количество RCP любого конкретного вида может быть зарегистрировано без ингибирования в ситуациях мультиплексирования, 100 фМ одной кольцевой цепи ДНК смешивали с отдельной кольцевой цепью ДНК в соотношениях; 1: 0, 1: 1, 1:10, 1: 100, 1: 1000, 1:10 000 и 1: 100 000.Образцы иммобилизовали на твердой подложке и проанализировали, как описано выше. Олигонуклеотиды для специфического обнаружения, конъюгированные с различными флуорофорами (Cy3 и Cy5), использовали для окрашивания RCP, полученных из двух различных кольцевых матриц. Этот эксперимент был повторен один раз с тем же результатом.

Олигонуклеотиды уплотнения

Мы исследовали, как на формы RCP повлияло добавление PEG 4000 по сравнению с олигонуклеотидами уплотнения во время RCA, те же олигонуклеотидные последовательности и протокол использовались, как описано ранее, для успешного уплотнения RCP (16), с добавлением конечной концентрации и без него. 15% ПЭГ 4000 в смеси RCA или только с 15% ПЭГ 4000.

ELISA измерение PSA

Коммерческий набор ELISA для измерения ПСА (Fujirebio, CanAg PSA EIA, ref 340-10, IVD, CE 0197 ) вместе с неконъюгированными антителами был любезно предоставлен доктором Кристианом Фермером из Fujirebio. Набор состоял из двух моноклональных антител против PSA; один конъюгирован с биотином для иммобилизации детектирующего комплекса на твердой подложке (захватывающее антитело), ​​а другой конъюгирован с пероксидазой хрена (HRP) (детектирующее антитело) для генерации детектируемого сигнала при добавлении 3,3 ‘, 5,5’-тетраметилбензидина (TMB).ELISA выполняли в соответствии с инструкциями производителя. Вкратце, как улавливающие, так и детектирующие антитела инкубировали вместе с образцами в покрытых стрептавидином стрип-лунках (96-луночный формат) в течение одного часа при комнатной температуре с последующим генерированием сигнала при добавлении раствора TMB и инкубации в течение 30 минут при комнатной температуре. . Сигнал регистрировали как оптическую плотность при 420 нМ с использованием многомодового ридера для микропланшетов Tecan Spark. Для всех оценок использовали трехкратные технические повторы, и значения оптической плотности были преобразованы в журнал 10 для целей визуализации данных.Калибровочная кривая с девятью шагами между 100 и 60 мкг / л была построена с использованием калибраторов PSA, включенных в набор, и проанализирована вместе с отрицательным контролем. Шестиступенчатую серию разведений от 100 пг / л до 10 мкг / л готовили в объединенном образце женской плазмы и анализировали вместе с плазмой без добавок. Значения LOD были рассчитаны как концентрации, дающие сигналы на три стандартных отклонения выше средних фоновых значений. Количество образца в каждой лунке составляло 25 мкл.

Цифровое иммуно-RCA измерение PSA

Иммуно-RCA-анализ выполняли в условиях, максимально приближенных к условиям измерения ELISA.Единственная разница в реагентах заключалась в том, что детектирующее антитело было конъюгировано с коротким олигонуклеотидом ДНК со свободным 3′-концом (подробное описание приведено в дополнительном материале) и затем гибридизовано с кругом ДНК. Круг ДНК создавали циркуляризацией линейного олигонуклеотида ДНК с использованием олигонуклеотида, конъюгированного с антителом, в качестве матрицы. Это было выполнено с использованием пятикратного молярного избытка циркуляризуемого олигонуклеотида по сравнению с антителами в 20 мкл смеси для лигирования, содержащей 1 мкМ конъюгированного антитела, 5 мкМ линейного олигонуклеотида ДНК, буфер для лигирования 1xT4, 1 мМ АТФ и 0.04 Ед / мкл ДНК-лигазы Т4 (Thermo Fisher Scientific). Смесь для лигирования инкубировали 60 мин при комнатной температуре. Распознавание антигена проводили аналогично набору ELISA с 60-минутной одностадийной реакцией распознавания и иммобилизации при комнатной температуре. Реакция распознавания состояла из 30 мкл стандарта PSA (та же серия разведений, что и для исследований ELISA, описанных выше) и 40 мкл смеси антител с 3,3 нМ детектирующего антитела и 6,7 нМ улавливающего антитела. Инкубацию с распознаванием проводили в 16-луночных камерах на предметном стекле, покрытом стрептавидином (используемом, как описано выше).Также RCA, детекционная инкубация и микроскопический анализ выполняли, как описано выше, за тем исключением, что декстрансульфат был исключен из смеси для детектирования олигонуклеотидов. Для каждого образца было снято шесть изображений из разных мест. Эффективность рассчитывалась на основе заявленного количества PSA в добавленных калибраторах, среднего количества сигналов на одном изображении выше LOD и отношения между площадью одного изображения и одной лунки (0,96%) как

$$ \ begin {уравнение * } {\ rm Eff} \ left (\% \ right) = \ frac {{({N _ {{\ rm сигналов}}} – {\ rm LOD})}} {{0.0096 \ \ times {N _ {{\ rm added}}}} \ \ times 100 \ end {формула *} $$

Значения LOD были рассчитаны на три стандартных отклонения выше средних фоновых значений. Цифровые иммуно-RCA эксперименты проводились несколько раз в процессе оптимизации, и выводы каждого из этих экспериментов были одинаковыми.

Образцы плазмы

Образцы плазмы с ЭДТА у мужчин и женщин, использованные для измерения уровня ПСА, были объединены от нескольких добровольных доноров крови, взятых из центра крови при университетской больнице Упсалы.Образцы полностью анонимны, личные или клинические данные недоступны. Согласно шведскому закону (2003: 460) об этической проверке исследований с участием людей для этих анонимных и объединенных образцов не требовалось явного этического разрешения или специального согласия.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Упрощенный модельный эксперимент, основанный на иммобилизации кругов ДНК на предметных стеклах микроскопа, покрытых стрептавидином, был использован для оценки различных свойств, связанных с генерацией и цифровой записью RCP на твердой основе (рис. 1).Мы также оценили более реалистичное применение сверхчувствительного определения ПСА с помощью цифрового иммуно-RCA анализа и сравнили его со стандартным ИФА с аналоговым считыванием.

КПД RCA

Воздействие ПЭГ и размера и последовательности круглого шаблона на RCA

Мы заметили, что добавление ПЭГ 4000 до конечной концентрации 10–20% в реакциях RCA было полезным для получения RCP в больших количествах, которые также были более похожими по размеру и в целом более высокой интенсивности (Рисунок 2A и дополнительный рисунок S1A) .Без ПЭГ RCP довольно тусклые, неоднородные и беспорядочно вытянутые на поверхности с несколькими локальными пятнами более высокой интенсивности, что препятствует точному подсчету. Наивысшая средняя интенсивность и однородность RCP постоянно достигаются при использовании 15% PEG. Анализ с использованием программного обеспечения CellProfiler подтвердил, что присутствие 15% ПЭГ привело к получению наиболее округлой и однородной популяции RCP, что упростило идентификацию и цифровую запись (дополнительный рисунок S2). Эта концентрация использовалась для всех последующих экспериментов, если не указано иное.

Джоффрой и его коллеги недавно сообщили, что эффективность RCA зависит от размера круга ДНК, образующего реакцию. Было показано, что эффективность периодически изменяется с максимумом каждые 10,5 нуклеотидов, число, которое соответствует длине одного витка двойной спирали ДНК (13). Мы смогли подтвердить эти результаты, поскольку наши результаты ясно демонстрируют, что кольцевые матрицы из 68 и 79 нуклеотидов (ранее описанные максимумы) генерировали значительно более яркие RCP по сравнению с матрицами кольцевых ДНК из 63 и 73 нуклеотидов (ранее описанные минимумы) (рис. 2B и дополнительный рисунок S1B).Самые яркие RCP были получены с использованием кольцевой матрицы из 68 нуклеотидов, и, следовательно, этот размер матрицы использовался в следующих экспериментах, если не указано иное.

Эффективность RCA также зависит от состава последовательности кругов ДНК, при этом высокое содержание цитидина и аденозина увеличивает эффективность RCA в фазе раствора (14). Мы могли бы подтвердить это утверждение также для RCA, выполненного на плоских твердых подложках, продемонстрировав более высокую среднюю яркость для круглых матриц, богатых цитидином и аденозином, по сравнению с пулом олигонуклеотидов с сегментами случайной последовательности или конкретной последовательностью, которая включает палиндромные, самокомплементарные элементы (рисунок 2C и дополнительный рисунок S1C).Оцениваемые палиндромные элементы используются для создания уплотненных RCP в растворе в качестве шаблонов секвенирования компанией Complete Genomics (Сан-Хосе, США) (19).

Эффективность иммобилизации и обнаружения

Анализ dPCR использовался для определения того, какая часть циркуляризованных целевых молекул, которые могут быть захвачены на покрытой стрептавидином поверхности, в то время как цифровой подсчет RCP с помощью микроскопии использовался для оценки того, какая часть захваченных кольцевых цепей ДНК может образовывать RCP и, таким образом, быть обнаруженным (рисунок 3).Серия 10-кратных разведений кольцевых ДНК-матриц была проанализирована в трех повторностях с помощью dPCR с очень низкой вариабельностью и высокой линейностью (рис. 3A). Как измеренные молекулы ДНК входного образца, нанесенные на твердую подложку, так и молекулы ДНК, которые не смогли прикрепиться к подложке, находились в линейном динамическом диапазоне. Мы постоянно наблюдали, что в используемых условиях чуть более 50% входных молекул были прикреплены к твердой подложке (на основе измеренных входных молекул по сравнению с несвязанными молекулами), и все захваченные круги ДНК были обнаружены с помощью RCA, визуализации и подсчета RCP. (Рисунок 3B).Мы подтвердили, что анализ dPCR распознал только циркуляризованные, а не линейные матрицы ДНК, что продемонстрировано сравнением с линейными матрицами, добавленными в различных концентрациях (рис. 3C). Используемые олигонуклеотиды представляли собой олигонуклеотид dPCR 68nt (подлежащий циркуляризации), биопраймер A и прямой и обратный праймеры dPCR (таблица 1).

Мы исследовали возможность ускорения иммобилизации круглых шаблонов на твердой подложке путем сушки образца на поверхности, покрытой стрептавидином. PBST с 15% PEG дал лучшие результаты, чем при использовании PBST или PBS без PEG, за счет получения высушенной области образца с равномерным распределением сигналов (дополнительный рисунок S6).В соответствии с предыдущим отчетом (20) заметный эффект «кофейного пятна» (обогащение сигналов по периферии) был замечен в образцах без ПЭГ. Однако эффективность иммобилизации и обнаружения была относительно низкой, около 1% от теоретического максимума, и, следовательно, значительно менее эффективной, чем инкубация в течение двух часов без сушки.

Действие олигонуклеотидов компактизацией на RCP

Компактные олигонуклеотиды представляют собой олигонуклеотиды, которые состоят из двух идентичных частей, комплементарных мотивам в повторяющихся последовательностях, составляющих RCP (16).Целью использования олигонуклеотидов для уплотнения является сближение удаленных областей RCP и, следовательно, предотвращение распространения RCP на твердой основе. Олигонуклеотиды уплотнения действительно ограничивали размеры RCP на поверхностях, хотя яркость генерированных RCP была ниже, чем ожидалось, и количество обнаруженных сигналов было в 25 раз ниже по сравнению с использованием 15% PEG 4000 (дополнительный рисунок S5). Комбинация 15% PEG 4000 и олигонуклеотидов для уплотнения немного снижала как количество, так и среднюю яркость генерируемых RCP по сравнению с 15% PEG 4000 отдельно.Мы пришли к выводу, что добавление ПЭГ без олигонуклеотидов уплотнения является предпочтительным для создания RCP, которые могут быть эффективно записаны.

Последовательное мультиплексирование

Регистрация RCP на плоских поверхностях дает возможность цифрового считывания продуктов реакции в мультиплексе. Мы обнаружили, что, используя механизм замещения цепи, мы можем комбинировать удаление детектирующих олигонуклеотидов из ранее отображенных RCP с одновременным окрашиванием новых наборов RCP в процессе, который можно циклически повторять.Чтобы продемонстрировать процедуру, мы использовали две разные кольцевые матрицы, одна из которых RCP была специфически распознавалась Cy3-конъюгированными детектирующими олигонуклеотидами, в то время как продукты другого круга ДНК были обнаружены с помощью Cy5 (рисунок 4). В первом цикле обнаружения оба детектирующих олигонуклеотида, каждый из которых мечен одним из двух флуорофоров, использовали для окрашивания RCP с двумя специфичностями. Во втором цикле замещающие олигонуклеотиды для зондов, меченных Cy5, объединяли с олигонуклеотидами для обнаружения Cy3.В третьем цикле была добавлена ​​обратная комбинация реагентов, то есть замещающие олигонуклеотиды для зонда, меченного Cy3, вместе с зондами обнаружения, меченными Cy5. Наконец, в четвертом цикле добавляли те же реагенты, что и во втором цикле, удаляя зонды Cy5 и окрашивая зондами Cy3. Замещающие олигонуклеотиды эффективно обесцвечивали соответствующие детектирующие олигонуклеотиды, в то время как одновременно была выявлена ​​другая специфичность RCP с использованием соответствующих детектирующих олигонуклеотидов (фиг.4, две крайние правые панели).

Рисунок 4.

Возможность выполнения последовательного мультиплексирования была продемонстрирована с использованием двух различных кольцевых цепей матричной ДНК, детектируемых с помощью олигонуклеотидов, конъюгированных с Cy3 и Cy5, соответственно. Олигонуклеотиды-вытеснители использовали для удаления окрашивания ранее отображаемых RCP посредством смещения цепи ДНК, опосредованного toehold, и в той же реакции окрашивались новые RCP, которые должны были быть отображены. Показаны четыре цикла обесцвечивания и окрашивания.

Рисунок 4.

Возможность выполнения последовательного мультиплексирования была продемонстрирована с использованием двух различных кольцевых цепей ДНК-матрицы, обнаруженных с помощью олигонуклеотидов, конъюгированных с Cy3 и Cy5, соответственно. Олигонуклеотиды-вытеснители использовали для удаления окрашивания ранее отображаемых RCP посредством смещения цепи ДНК, опосредованного toehold, и в той же реакции окрашивались новые RCP, которые должны были быть отображены. Показаны четыре цикла обесцвечивания и окрашивания.

Динамический диапазон

Имея возможность использовать RCA на поверхностях для анализа биомолекул, концентрация которых может изменяться в широком диапазоне концентраций, мы хотели оценить, в каких динамических диапазонах можно проводить измерения.Динамический диапазон и однородность сигналов на твердой подложке были исследованы путем визуализации 5-кратных разведений круглых шаблонов, добавленных к твердой подложке (рис. 5А). Сигналы, представляющие RCP, были равномерно распределены по поверхности (номера трех определений показаны черными ромбами). Количество сигналов можно было разрешить индивидуально, и они линейно увеличивались в 10 000-кратном диапазоне концентраций (от 1 фМ до 10 пМ). Результаты демонстрируют возможность регистрации абсолютного числа молекул в образце на основе рассчитанной линии линейной регрессии log-log с наклоном 0.97, близко к теоретическому наклону, равному 1. Чувствительность настоящего анализа находится на одном фемтомолярном уровне, и площадь иммобилизации можно регулировать в соответствии с реакционными объемами.

Рисунок 5.

Оценка линейности, динамического диапазона и насыщения усиления круглых шаблонов на твердой опоре. ( A ) Динамический диапазон оценивали с использованием серии пятикратных разведений от 100 пМ до 1 фМ вместе с отрицательным контролем (буфер для иммобилизации без круглых матриц).Для каждой концентрации были получены три изображения, и зарегистрированные числа RCP отображены на диаграмме рассеяния. Серая линия представляет собой логарифмическую линейную регрессию, рассчитанную на основе среднего количества RCP на изображение для пяти концентраций от 6 фМ до 4 пМ. Наклон линии регрессии на уровне 0,97 очень близок к 1, что соответствует идеальной абсолютной количественной оценке. Было продемонстрировано, что динамический диапазон составляет около 10 000 раз (от 1 фМ до 10 пМ) с превосходной линейностью. ( B ) Динамический диапазон настоящего способа с цифровым подсчетом сравнивали с аналоговым измерением общей флуоресценции на лунку с использованием планшет-ридера для 96-луночных μ-прозрачных планшетов, покрытых стрептавидином.Из-за более низкого фона цифровое измерение может регистрировать в несколько тысяч раз меньшее количество по сравнению с аналоговым. ( C ) Обнаружение RCP из определенного круга ДНК оценивали как функцию увеличения числа общих кругов ДНК. 100 фМ кружков, детектированных с использованием зондов для детектирования, меченных Cy5 (синие точки), смешивали в соотношениях от 1: 0 до 1: 100 000 с кружками, детектированными зондами, меченными Cy3 (зеленые точки). Количество RCP, меченных Cy5, рассчитывали по шести изображениям, полученным при каждом соотношении.Эти значения были визуализированы на диаграмме рассеяния (вверху) с подсчетами Cy5 на оси y и добавленными соотношениями кругов ДНК, образующими RCA, отображаемыми на оси x. Серая линия представляет собой среднее значение RCP, меченных Cy5, демонстрируя близкую эффективность обнаружения во всех образцах, за исключением того, где 100-кратный избыток круга ДНК, RCP которого были обнаружены зеленым цветом.

Рисунок 5.

Оценка линейности, динамического диапазона и насыщения усиления круглых шаблонов на твердой опоре.( A ) Динамический диапазон оценивали с использованием серии пятикратных разведений от 100 пМ до 1 фМ вместе с отрицательным контролем (буфер для иммобилизации без круглых матриц). Для каждой концентрации были получены три изображения, и зарегистрированные числа RCP отображены на диаграмме рассеяния. Серая линия представляет собой логарифмическую линейную регрессию, рассчитанную на основе среднего количества RCP на изображение для пяти концентраций от 6 фМ до 4 пМ. Наклон линии регрессии на уровне 0,97 очень близок к 1, что соответствует идеальной абсолютной количественной оценке.Было продемонстрировано, что динамический диапазон составляет около 10 000 раз (от 1 фМ до 10 пМ) с превосходной линейностью. ( B ) Динамический диапазон настоящего способа с цифровым подсчетом сравнивали с аналоговым измерением общей флуоресценции на лунку с использованием планшет-ридера для 96-луночных μ-прозрачных планшетов, покрытых стрептавидином. Из-за более низкого фона цифровое измерение может регистрировать в несколько тысяч раз меньшее количество по сравнению с аналоговым. ( C ) Обнаружение RCP из определенного круга ДНК оценивали как функцию увеличения числа общих кругов ДНК.100 фМ кружков, детектированных с использованием зондов для детектирования, меченных Cy5 (синие точки), смешивали в соотношениях от 1: 0 до 1: 100 000 с кружками, детектированными зондами, меченными Cy3 (зеленые точки). Количество RCP, меченных Cy5, рассчитывали по шести изображениям, полученным при каждом соотношении. Эти значения были визуализированы на диаграмме рассеяния (вверху) с подсчетами Cy5 на оси y и добавленными соотношениями кругов ДНК, образующими RCA, отображаемыми на оси x. Серая линия представляет собой среднее значение RCP, меченных Cy5, демонстрируя близкую эффективность обнаружения во всех образцах, за исключением того, где 100-кратный избыток круга ДНК, RCP которого были обнаружены зеленым цветом.

Компьютерный подсчет RCP на плоских поверхностях дает возможность получать цифровые измерения любой молекулы, присутствие которой в образце может быть представлено образованием кольцевых цепей ДНК. Мы сравнили чувствительность и точность цифровых и аналоговых измерений RCP путем подсчета отдельных RCP или измерения интегрального сигнала флуоресценции по поверхности. Это сравнение проводилось путем покрытия μ-прозрачных 96-луночных лунок планшета стрептавидином, присоединения 10-кратных разведений биотинилированных олигонуклеотидных праймеров, гибридизованных с кольцевыми матрицами ДНК, выполнения RCA и последующей регистрации результатов либо с использованием цифрового подсчета с помощью флуоресцентной микроскопии, либо путем измерения общего флуоресценция в планшет-ридере (рис. 5В).Результаты демонстрируют, что цифровой подсчет посредством визуализации намного более чувствителен, поскольку позволяет избежать фоновых сигналов, а ответы были более пропорциональными и точными по сравнению с аналоговыми измерениями, которые выявили только сигналы выше фона для двух самых высоких исследованных концентраций.

Важным аспектом, который может ограничить степень мультиплексирования и диапазоны концентраций, в которых могут быть измерены аналиты, является ингибирование за счет полного поверхностного насыщения из-за специфичности множества круглых шаблонов.Чтобы оценить этот эффект, кольцевую матрицу, распознаваемую конъюгированными с Cy5 детектирующими олигонуклеотидами, анализировали при добавлении вместе с увеличивающимся количеством другой кольцевой ДНК-матрицы, способной гибридизоваться с тем же биотинилированным олигонуклеотидом для захвата поверхности, но детектируемой с использованием отдельного Cy3-конъюгированного детектирующий олигонуклеотид (рис. 5C). Мы обнаружили, что даже 10 000-кратный избыток кругов ДНК, чьи RCP были обнаружены с помощью Cy3 (1 нМ), не влиял на количество RCP, обнаруживаемых с помощью Cy5, добавленных при 100 фМ.Сигналы Cy3 с концентрацией 10 пМ и выше не поддаются индивидуальному разрешению (зеленый цвет на нижних правом изображениях).

Сверхчувствительное цифровое измерение уровня ПСА с помощью иммуно-RCA

Чтобы изучить преимущества нашей платформы цифрового считывания, мы разработали цифровой иммуно-RCA-анализ, нацеленный на ПСА, и сравнили его с коммерческим сэндвич-ELISA с использованием той же пары антител (рис. 6). Измерения титров ПСА в буфере с помощью цифрового иммуно-RCA продемонстрировали диапазон обнаружения от 100 пг / л до 10 мкг / л, охватывающий пять порядков величины (рис. 6, верхняя левая панель).Соответствующие значения для ELISA составляли 500 нг / л и 60 мкг / л – более скромные 2 порядка величины (хотя верхний предел не был достигнут при наивысшей концентрации ПСА в серии разведений) (рис. 6, нижняя левая панель). . Следовательно, чувствительность была более чем на три порядка выше, когда отдельные события детектирования были подсчитаны с использованием цифрового считывания с помощью иммунного RCA, по сравнению с аналоговым считыванием с использованием ELISA. Абсолютная эффективность обнаружения (то есть обнаруженная доля добавленных молекул PSA) при титровании в буфере, измеренная с помощью цифрового иммуно-RCA, составляла в среднем ∼1% (расчет основан на подсчете RCP на изображении, представляющем 0.96% от общей выборки). Также были проанализированы титры ПСА между 100 пг / л и 10 мкг / л в объединенной женской плазме (рис. 6, правые панели). Неизвестный эндогенный уровень ПСА в объединенном образце женской плазмы оценивается как низкий нг на литр при измерении с помощью цифрового иммуно-RCA, но не обнаруживаемый при измерении с помощью ELISA. Повышенный уровень обнаружения для женской плазмы без добавок по сравнению с буфером при измерении с помощью иммуно-RCA может частично быть из-за увеличения неспецифических сигналов из-за сложной матрицы.Чувствительность обнаружения PSA, повышенного в плазме женщин, была выше при использовании цифрового иммуно-RCA по сравнению с ELISA, но не такой поразительной, как при титровании в буфере. Вероятно, это связано с тем, что эндогенный PSA в женской плазме регистрируется с помощью сверхчувствительного цифрового иммуно-RCA анализа. Одна и та же пара антител использовалась для цифрового иммунного RCA и ELISA, и реакции распознавания были очень похожими. RCP, полученные в результате отдельных событий обнаружения с помощью иммуно-RCA, представляли собой интенсивные круглые точки флуоресценции, которые было легко подсчитать (дополнительный рисунок S8).Две различные концентрации детектирующих антител были исследованы на иммуно-ПКА (дополнительный рисунок S9). И фоновый, и истинный сигналы уменьшились примерно в 10 раз, когда концентрация детектируемых антител была уменьшена в 10 раз, демонстрируя очень похожие характеристики детектирования при обеих концентрациях.

Рисунок 6.

Измерение разведений ПСА в буферной и женской плазме с помощью цифрового иммуно-RCA и ELISA. Самая низкая полученная концентрация ПСА составляла 100 пг / л, а самая высокая – 60 и 10 мкг / л для буферной и женской плазмы соответственно.Отрицательные контроли использовали для расчета LOD как трех стандартных отклонений выше среднего. Шесть изображений из каждого образца анализировали с помощью цифрового иммуно-RCA, а образцы в трех экземплярах анализировали с помощью ELISA. Более чем на три порядка большая чувствительность была достигнута при измерении PSA в буфере с цифровым иммунным RCA (~ 100 пг / л) по сравнению с ELISA (~ 500 нг / л) (левые панели). Разница в чувствительности была не такой большой для ПСА, введенного в плазму женщин, скорее всего, из-за низкого уровня эндогенного ПСА, который можно было зарегистрировать только с помощью цифрового иммуно-RCA.В обоих методах использовалась одна и та же пара моноклональных антител против PSA. Захватывающее антитело конъюгировали с биотином, а детектирующее антитело конъюгировали с ДНК или HRP для цифрового иммуно-RCA и ELISA, соответственно. Значения процентов в верхней левой панели представляют эффективность обнаружения, то есть обнаруженную долю добавленных молекул PSA.

Рисунок 6.

Измерение разведений ПСА в буферной и женской плазме с помощью цифрового иммуно-RCA и ELISA. Самая низкая полученная концентрация ПСА составляла 100 пг / л, а самая высокая – 60 и 10 мкг / л для буферной и женской плазмы соответственно.Отрицательные контроли использовали для расчета LOD как трех стандартных отклонений выше среднего. Шесть изображений из каждого образца анализировали с помощью цифрового иммуно-RCA, а образцы в трех экземплярах анализировали с помощью ELISA. Более чем на три порядка большая чувствительность была достигнута при измерении PSA в буфере с цифровым иммунным RCA (~ 100 пг / л) по сравнению с ELISA (~ 500 нг / л) (левые панели). Разница в чувствительности была не такой большой для ПСА, введенного в плазму женщин, скорее всего, из-за низкого уровня эндогенного ПСА, который можно было зарегистрировать только с помощью цифрового иммуно-RCA.В обоих методах использовалась одна и та же пара моноклональных антител против PSA. Захватывающее антитело конъюгировали с биотином, а детектирующее антитело конъюгировали с ДНК или HRP для цифрового иммуно-RCA и ELISA, соответственно. Значения процентов в верхней левой панели представляют эффективность обнаружения, то есть обнаруженную долю добавленных молекул PSA.

ОБСУЖДЕНИЕ

Основываясь на достижениях в технологиях молекулярного обнаружения, большие наборы биологических образцов в настоящее время анализируются на предмет наличия огромного количества молекулярных характеристик в поисках новых биомаркеров.Цель состоит в том, чтобы проверить обнаруженные биомаркеры для применения в повседневной клинической практике, и улучшенные средства считывания реакций обнаружения являются высокоприоритетной задачей. Цифровая запись отдельных молекул-мишеней или молекулярных событий в образцах обеспечивает наиболее точную количественную оценку, а цифровые технологии ПЦР служат золотым стандартом. Эти технологии основаны на индивидуальных реакциях детектирования, основанных на ПЦР, которые изначально были предусмотрены изобретателем ПЦР (21). В методе используются специализированные приборы, а пропускная способность и динамические диапазоны ограничены в зависимости от количества используемых отсеков.Мы сообщаем об альтернативном подходе, при котором отдельные кольцевые молекулы ДНК локально амплифицируются с помощью RCA на плоских твердых носителях и подсчитываются с помощью флуоресцентной микроскопии с анализом изображений. Эта платформа обнаружения имеет преимущества в виде меньшей зависимости от специального оборудования и повышенного потенциала для мультиплексирования и высокой пропускной способности.

В настоящем исследовании мы продемонстрировали, что 15% ПЭГ обеспечивает превосходную эффективность RCA, создавая ровные округлые RCP, оптимальные для цифрового обнаружения, когда RCA выполняли на предметных стеклах микроскопа, покрытых стрептавидином.ПЭГ ранее использовался для молекулярного краудинга, чтобы обеспечить более эффективные ферментативные реакции. В более раннем исследовании способность PEG облегчать гибридизацию олигонуклеотидов, подлежащих лигированию, и поддерживать их лигирование, рассматривалась как главное преимущество RCA кругов ДНК, иммобилизованных на магнитных шариках (12). Наши результаты здесь демонстрируют ценность включения ПЭГ во время RCA как для эффективного распознавания комплекса праймер-круг ДНК на носителе, так и для получения RCP равномерной формы.Наши результаты относятся к RCA, выполненной на предметных стеклах микроскопа, покрытых стрептавидином, в то время как добавление PEG не улучшило количество или форму RCP, генерируемых с помощью in situ PLA в клетках или тканях или когда RCA проводилась в растворе, согласно предварительным результатам ( данные не представлены). В более раннем исследовании было показано, что ПЭГ ускоряет гибридизацию олигонуклеотидов в растворе с олигонуклеотидами, иммобилизованными на наночастицах золота, но не наблюдалось никакого влияния на гибридизацию олигонуклеотидов в растворе (22).ПЭГ может взаимодействовать с поверхностями, тем самым снижая склонность ДНК к неспецифическому связыванию и, таким образом, позволяя олигонуклеотидам выходить от поверхности, а не прилипать к ней. Это может сделать иммобилизованную ДНК более доступной для гибридизации и распознавания ферментами. Более округлая форма RCP, которую мы наблюдали в среде PEG, может быть связано с уменьшением взаимодействия RCP с поверхностью, что позволяет продуктам принимать однородную случайную форму спирали, наблюдаемую как точечные флуоресцентные пятна.Однажды сформированная форма RCP сохраняется также при удалении PEG после RCA.

Основное внимание в нашем исследовании было уделено поиску условий для эффективного подсчета продуктов кольцевых цепей ДНК. Автоматизация может значительно увеличить пропускную способность, надежность и удобство метода, особенно для высоких степеней мультиплексирования.

RCA, выполненная в растворе, чувствительна к мешающим молекулам, например нуклеиновые кислоты в образце или добавленные в качестве реагентов. Если такие молекулы не удаляются через e.грамм. При обработке экзонуклеазой они могут действовать как праймеры путем гибридизации с продуктом репликации, что приводит к накоплению как одноцепочечных, так и двухцепочечных продуктов амплификации в плохо контролируемых гиперразветвленных реакциях RCA, которые не подходят для цифрового подсчета (23). Когда круглые шаблоны для RCA прикреплены к твердой опоре, условия RCA можно легко контролировать, обеспечивая оптимальную цифровую запись данных. Тем не менее, также можно выполнять RCA в растворе и улавливать продукты на плоских поверхностях, например, с помощью фильтрации для цифрового подсчета сигналов для достижения высокой точности и чувствительности (9,10).Такие анализы могут служить для идентификации целевой ДНК, полученной от плода с избыточной хромосомой 21 в крови матери, для неинвазивной пренатальной диагностики (НИПТ) (9,10).

Широкий спектр классов биомаркеров в различных типах образцов может быть проанализирован с помощью цифрового обнаружения RCA, если анализы позволяют представлять целевые молекулы небольшими кольцевыми одноцепочечными молекулами ДНК. Обнаружение молекул ДНК и РНК может привести к образованию амплифицируемых кольцевых цепей ДНК с помощью высокоспецифичных зондов с замком (3,4,24,25,10).Белковые анализы могут давать RCP с помощью иммуно-RCA (5) или с помощью тестов лигирования близости, которые зависят от связывания мишени парами антител, тем самым обеспечивая повышенную специфичность обнаружения и регистрации взаимодействующих пар белков (8,26). Точно так же линейные цепи ДНК, полученные в результате анализов ПЦР или, например, анализов протеина удлинения близости, могут быть преобразованы в круги ДНК для считывания путем цифрового подсчета RCP. (27,28).

Цифровое считывание обеспечивает не только повышенную точность по сравнению с аналоговыми измерениями, но также может повысить чувствительность обнаружения.Мы демонстрируем здесь более чем на три порядка большую чувствительность при измерении PSA с помощью цифрового иммуно-RCA анализа по сравнению с соответствующим аналоговым ELISA. Процедуры для двух анализов должны быть как можно более похожими, например, с использованием той же пары моноклональных антител и аналогичной стратегии распознавания и иммобилизации мишени в соответствии с рекомендациями для коммерческого анализа. Существенным различием между двумя методами была стратегия считывания. Цифровой иммуно-RCA служил для подсчета отдельных событий обнаружения с помощью локализованных сигналов флуоресценции, которые были четко различимы на фоне фонового шума.Напротив, ELISA измерял общие сигналы как комбинацию захваченных реагентов для обнаружения и неспецифического фонового поглощения. Таким образом, различные стратегии считывания являются основной причиной значительного повышения чувствительности, достигаемой с помощью иммуно-RCA. При иммунной RCA только реагенты для обнаружения, связанные либо в результате специфической реакции обнаружения, либо из-за перекрестных реакций с нецелевыми объектами, либо из-за неспецифического прилипания в лунках для анализа, могут давать поддающиеся обнаружению сигналы.

Важность высокочувствительных белковых анализов в молекулярной диагностике, вероятно, возрастет.Такие анализы могут позволить обнаруживать следовые количества биомаркеров утечки, попадающих в кровоток из-за болезненных процессов в любом месте тела. Также вероятно, что будущая диагностика болезни будет зависеть от измерения не одного, а набора биомаркеров, поскольку множественные исследования могут лучше различать болезненные состояния.

ПСА – хорошо известный биомаркер рака простаты. Возможность измерения концентрации ПСА на уровне или ниже нг на литр может позволить раннее выявление рецидива у пациентов с раком простаты, подвергшихся хирургическому лечению (29,30), а также потенциально может помочь в диагностике гиперандрогении при синдроме поликистозных яичников, который является частой причиной репродуктивной функции. и метаболическая дисфункция у женщин (31).Концентрация PSA в объединенном образце женской плазмы, который мы проанализировали, составляла ~ 2 нг / л в соответствии со стандартами PSA, приготовленными в буфере, при измерении с помощью иммуно-RCA. Кроме того, был проанализирован один объединенный образец мужской плазмы, который показал почти идентичные значения чуть ниже 1 мкг / л при измерении с помощью иммуно-RCA и ELISA. Значения как для мужских, так и для женских образцов с помощью цифрового иммуно-ПКА соответствуют литературным данным, в которых говорится, что циркулирующий ПСА, вероятно происходящий из ткани груди, обычно присутствует у здоровых женщин на уровнях <4 нг / л, что составляет ~ 1000 в несколько раз ниже нормы у мужчин (32,33).Эффективность обнаружения повышенного ПСА в женской плазме была ниже по сравнению с буфером при анализе с помощью иммуно-RCA. Это может быть связано с тем, что некоторые из детектирующих антител взаимодействуют с другими белками плазмы. Расчетная эффективность обнаружения (в среднем около 1%) для обнаружения ПСА в буфере с иммуно-RCA не совсем удовлетворительна и является потенциальной возможностью для дальнейшего повышения чувствительности, например, путем увеличения времени распознавания и иммобилизации антител.

В заключение, результаты нашего исследования предлагают альтернативные средства для цифровых реакций молекулярного обнаружения, помимо золотого стандарта dPCR, с такими преимуществами, как упрощенная аппаратура и повышенная способность мультиплексирования и пропускная способность.Представленный здесь метод считывания также подходит для цифрового измерения широкого диапазона классов биомолекул при условии, что реакция обнаружения приводит к появлению кругов ДНК, которые можно точно подсчитать после локальной амплификации на твердой подложке с помощью RCA.

ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ ДАННЫЕ

Дополнительные данные доступны в NAR Online.

БЛАГОДАРНОСТИ

Мы благодарны доктору Кристиану Фермеру, Fujirebio, за предоставленные реагенты для определения ПСА.

ФИНАНСИРОВАНИЕ

Шведский исследовательский совет [2017-04152, 2018-02943, 2018-06156 to U.L.]; Шведский фонд стратегических исследований [SB16-0046 для U.L.]. Финансирование для открытого доступа: Департамент иммунологии, генетики и патологии Ульфа Ландегрена, Университет Упсалы.

Заявление о конфликте интересов . У.Л. и J.B. являются изобретателями основанных на RCA методов молекулярного обнаружения.

ССЫЛКИ

1.

Фогельштейн

Б.

,

Kinzler

K.W.

Цифровая ПЦР

.

PNAS

.

1999

;

96

:

9236

–

9241

.2.

Пожар

A.

,

Xu

S.Q.

Роликовая репликация коротких кругов ДНК

.

Proc. Natl Acad. Sci. США

1995

;

92

:

4641

–

4645

.3.

Нильссон

М.

,

Мальмгрен

Х.

,

Samiotaki

M.

,

Kwiatkowski

M.

,

Chowdhary

B.P.

,

Landegren

U.

Зонды с замком: циркуляционные олигонуклеотиды для локализованного обнаружения ДНК

.

Наука

.

1994

;

265

:

2085

–

2088

.4.

Banér

J.

,

Nilsson

M.

,

Mendel-Hartvig

M.

,

Landegren

U.

Усиление сигнала датчиков висячих замков путем репликации по катящемуся кругу

.

Nucleic Acids Res.

1998

;

26

:

5073

–

5078

. 5.

Schweitzer

B.

,

Wiltshire

S.

,

Lambert

J.

,

O’Malley

S.

,

Kukanskis

K.

000

Zhu ,

Kingsmore

S.F.

,

Lizardi

P.M.

,

Ward

D.C.

Иммуноанализы с амплификацией ДНК по катящемуся кругу: универсальная платформа для сверхчувствительного обнаружения антигенов

.

Proc. Natl. Акад. Sci. США

2000

;

97

:

10113

–

10119

.6.

Schweitzer

B.

,

Roberts

S.

,

Grimwade

B.

,

Shao

W.

,

Ван

М.

,

Фу

Кв.

,

Шу

Кв.

,

Ларош

И.

et al. .

Мультиплексное профилирование белков на микрочипах с помощью амплификации по типу катящегося круга

.

Nat. Biotechnol.

2002

;

20

:

359

–

365

.7.

Fredriksson

S.

,

Gullberg

M.

,

Ярвиус

J.

,

Olsson

C.

,

Pietras

K.

,

Gústafsdóttir

S.M.

,

Östman

A.

,

Landegren

U.

Обнаружение белков с помощью анализа лигирования ДНК, зависимого от близости

.

Nat. Biotechnol.

2002

;

20

:

473

–

477

.8.

Söderberg

O.

,

Gullberg

M.

,

Jarvius

M.

,

Ridderstråle

K.

,

Leuchowius

K.-J.

,

Jarvius

J.

,

Wester

K.

,

Hydbring

P.

,

Bahram

F.

,

Larsson

L.-G.

et al. .

Прямое наблюдение индивидуальных эндогенных белковых комплексов in situ путем лигирования близости

.

Nat. Методы

.

2006

;

3

:

995

–

1000

.9.

Kühnemund

M.

,

Hernández-Neuta

I.

,

Sharif

M.I.

,

Cornaglia

M.

,

Gijs

M.A.M.

,

Nilsson

M.

Чувствительный и недорогой цифровой анализ ДНК путем микрофлюидного обогащения амплифицированных одиночных молекул по катящемуся кругу

.

Nucleic Acids Res.

2017

;

45

:

e59

.10.

Даля

F.

,

Ericsson

O.

,

Karlberg

O.

,

Karlsson

F.

,

Howell

M.

,

Persson

F.

,

Roos F.

,

Roos

Stenberg

J.

,

Ahola

T.

,

Alftrén

I.

et al. .

Визуализация одиночных молекул ДНК для высокоточного НИПТ

.

Sci. Отчет

2018

;

8

:

4549

.11.

Ebai

T.

,

de Oliveira

F.M.S.

,

Löf

L.

,

Wik

L.

,

Schweiger

C.

,

Larsson

A.

,

Keilholtz

U.

,

Haybae

Landegren

U.

,

Kamali-Moghaddam

M.

Аналитически чувствительное обнаружение белков в микротитровальных планшетах методом бесконтактного лигирования с амплификацией по катящемуся кругу

.

Clin. Chem.

2017

;

63

:

1497

–

1505

.12.

Sasaki

N.

,

Gunji

Y.

,

Kase

C.

,

Sato

K.

Молекулярное скопление улучшает усиление катящегося круга висячих замков на основе шариков

.

Анал. Biochem.

2017

;

519

:

15

–

18

. 13.

Джоффрой

Б.

,

Uca

Y.O.

,

Prešern

D.

,

Doye

J.P.K.

,

Schmidt

T.L.

Усиление в виде катящегося круга показывает зависящее от длины синусоидального шаблона смещение усиления

.

Nucleic Acids Res.

2018

;

46

:

538

–

545

. 14.

Mao

Y.

,

Liu

M.

,

Трамвай

K.

,

Gu

J.

,

Salena

B.J.

,

Jiang

Y.

,

Li

Y.

Оптимальные шаблоны ДНК для амплификации по катящемуся кругу, выявленные с помощью отбора in vitro

.

Химия

.

2015

;

21

:

8069

–

8074

. 15.

Lamprecht

M.R.

,

Sabatini

D.M.

,

Карпентер

А.E.

CellProfiler: бесплатное универсальное программное обеспечение для автоматического анализа биологических изображений

.

Биотехника

.

2007

;

42

:

71

–

75

. 16.

Clausson

C.-M.

,

Arngården

L.

,

Ishaq

O.

,

Klaesson

A.

,

Kühnemund

M.

,

Grannas

K.

,

,

Qian

X.

,

Ranefall

P.

,

Krzywkowski

T.

et al. .

Уплотнение продуктов усиления по катящемуся кругу увеличивает целостность сигнала и отношение сигнал / шум

.

Sci. Отчет

2015

;

5

:

12317

.17.

Юрке

Б.

,

Турберфилд

А.Дж.

,

Миллс

A.P.

,

Зиммель

F.C.

,

Neumann

J.L.

Молекулярная машина на основе ДНК, сделанная из ДНК

.

Природа

.

2000

;

406

:

605

–

608

. 18.

Чжан

D.Y.

,

Winfree

E.

Контроль кинетики смещения цепи ДНК с помощью toehold exchange

.

J. Am. Chem. Soc.

2009

;

131

:

17303

–

17314

.19.

Drmanac

R.

,

Sparks

A.B.

,

Callow

M.J.

,

Halpern

A.L.

,

Burns

N.L.

,

Kermani

B.G.

,

Карневали

П.

,

Назаренко

I.

,

Нильсен

Г.Б.

,

Yeung

G.

et al. .

Секвенирование генома человека с использованием считывания несвязанных оснований на самособирающихся наномассивах ДНК

.

Наука

.

2010

;

327

:

78

–

81

.20.

Seo

C.

,

Jang

D.

,

Chae

J.

,

Shin

S.

Изменение эффекта кофейного кольца путем добавления поверхностно-активного раствора вязкого полимера

.

Sci. Отчет

2017

;

7

:

500

.21.

Mullis

K.B.

Полимеразная цепная реакция в режиме анемии: как избежать холодного олигодезоксирибонуклеарного слияния

.

Genome Res.

1991

;

1

:

1

–

4

.22.

Zhang

X.

,

Huang

P.-J.J.

,

Servos

M.R.

,

Liu

J.

Влияние полиэтиленгликоля на адсорбцию и гибридизацию ДНК на наночастицах золота и оксиде графена

.

Ленгмюр

.

2012

;

28

:

14330

–

14337

. 23.

Лизарди

П.M.

,

Huang

X.

,

Zhu

Z.

,

Bray-Ward

P.

,

Thomas

DC

,

Ward

DC

Обнаружение мутаций подсчет молекул с использованием изотермической амплификации по катящемуся кругу

.

Nat. Genet.

1998

;

19

:

225

–

232

.24.

Hardenbol

P.

,

Banér

J.

,

Jain

M.

,

Nilsson

M.

,

Namsaraev

E.A.

,

Карлин-Нойман

Г.А.

,

Fakhrai-Rad

H.

,

Ronaghi

M.

,

Willis

T.D.

,

Landegren

U.

et al. .

Мультиплексное генотипирование с использованием зондов молекулярной инверсии с метками последовательностей

.

Nat. Biotechnol.

2003

;

21

:

673

–

678

.25.

Krishnakumar

S.

,

Zheng

J.

,

Wilhelmy

J.

,

Faham

M.

,

Mindrinos

M.

Davis

Комплексный анализ целевой мультиплексной амплификации последовательностей ДНК человека

.

Proc. Natl. Акад. Sci. США

2008

;

105

:

9296

–

9301

. 26.

Клаэссон

А.

,

Grannas

K.

,

Ebai

T.

,

Heldin

J.

,

Koos

B.

,

Leino

M.

,

Raykova D.

Oelrich

J.

,

Arngården

L.

,

Söderberg

O.

et al. .

Повышенная эффективность анализа белков in situ за счет лигирования близости с использованием зондов UnFold

.

Sci.Отчет

2018

;

8

:

5400

.27.

Assarsson

E.

,

Lundberg

M.

,

Holmquist

G.

,

Björkesten

J.

,

Bucht Thorsen

S.

man

,

Eriksson

A.

,

Rennel Dickens

E.

,

Ohlsson

S.

,

Edfeldt

G.

et al..

Гомогенный иммуноферментный анализ 96-Plex PEA, демонстрирующий высокую чувствительность, специфичность и отличную масштабируемость

.

PLoS One

.

2014

;

9

:

e95192

. 28.

Ke

R.Y.

,

Nong

R.Y.

,

Fredriksson

S.

,

Landegren

U.

,

Nilsson

M.

Повышение точности анализа методом бесконтактного лигирования за счет обнаружения одиночных молекул с усилением

.

PLoS One

.

2013

;

8

:

e69813

. 29.

Schaefer

U.

,

Witt

F.

,

Schueller

P.

,

Micke

O.

,

Willich

N.

, специфический для антигена простаты Мониторинг рака простаты после радикальной простатэктомии и внешнего лучевого облучения

.

Anticancer Res.

2000

;

20

:

4989

–

4992

.30.

McLeod

D.G.

Эффективное лечение биохимического рецидива у пациентов с раком простаты

.

Рев Урол

.

2005

;

7

:

S29

–

S36

.31.

Diamandis

E.P.

,

Станчик

F.Z.

,

Wheeler

S.

,

Mathew

A.

,

Stengelin

M.

,

Nikolenko

G.

,

Глезер

E.N.

,

Коричневый

M.D.

,

Zheng

Y.

,

Chen

Y.-H.

et al. .

Сывороточный комплекс и свободный простатоспецифический антиген (ПСА) для диагностики синдрома поликистозных яичников (СПКЯ)

.

Clin. Chem. Лаборатория. Med.

2017

;

55

:

1789

–

1797

.32.

Yu

H.

,

Diamandis

E.P.

Измерение уровней специфического антигена простаты в сыворотке крови у женщин и мужчин после простатэктомии с помощью сверхчувствительного иммуноанализа

.

J. Urol.

1995

;

153

:

1004

–

1008

. 33.

Melegos

D.N.

,

Diamandis

E.P.

Присутствует ли простатоспецифический антиген в женской сыворотке?

.

Clin. Chem.

1998

;

44

:

691

–

692

.

© Автор (ы) 2020. Опубликовано Oxford University Press от имени Nucleic Acids Research.

Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/), которая разрешает неограниченное повторное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии, что оригинал работа правильно процитирована.

Транспортировка молоди лосося мешает перевозке взрослых особей mi

Ученые обнаружили, что меры по управлению, направленные на содействие миграции лосося и стальной форели, могут иметь непредвиденные последствия для популяций рыб.Молодь, которую перевозят вниз по течению на лодках, может потерять способность мигрировать обратно в места размножения, что снижает их выживаемость и изменяет адаптацию в дикой природе.

Транспортные программы осуществляются уже более трех десятилетий для улучшения выживаемости рыб, которые вылупляются в реках, но мигрируют вниз по течению в океан, где они живут большую часть своей взрослой жизни. Затем взрослые плывут обратно по реке, чтобы спариваться, откладывать яйца и, наконец, умирают в том же месте, где они родились.Эти рыбы могут путешествовать на сотни миль и совершать впечатляющие восхождения по водопадам и мимо плотин.

Однако, когда плотины блокируют реки, мигрирующим рыбам, особенно молоди, может быть трудно перемещаться между их нерестилищами и открытым океаном.

«Молодые особи, пытающиеся вернуться в море, обычно проходят через водосбросы или мимо турбин плотины», – говорит Мэтью Кифер, биолог из Университета Айдахо и ведущий автор исследования, опубликованного в ноябрьском выпуске журнала Ecological Applications. .

Однако пролет мимо турбин плотины может привести к гибели многих молодых рыб. В ответ меры управления помогают лососю и стальной форели полностью избегать плотин, перевозя молодь мимо плотин в сторону океана на речных баржах.

Но Кифер обнаружил, что эта бесплатная поездка на пароме может создать проблемы, когда подростки вырастут. Он и его коллеги Кристофер Кодилл, Кристофер Пири и Стивен Ли из Университета Айдахо проследили закономерности передвижения взрослой особи лосося и стальной форели вдоль рек Колумбия и Снейк в Вашингтоне и Орегоне.Они обнаружили, что по сравнению с рыбами, которые мигрировали естественным путем, транспортированная молодь имела более низкую выживаемость во взрослом возрасте и с меньшей вероятностью вернулась домой.

«Взрослые рыбы обычно неуклонно движутся вверх по течению к своим нерестилищам, но некоторые вместо этого возвращаются вниз по течению через плотины», – говорит Кифер. Это явление, которое менеджеры рыболовства называют запасным, чаще встречается у взрослых особей, которые были выгнаны в молодости, чем у тех, кто мигрировал естественным путем.

«Непонятно, просто ли у них заканчивается пар, плывя вверх по реке, или они дезориентируются и возвращаются вниз по течению в поисках сигналов от своей родной реки», – говорит Кифер.

Ученые считают, что нахождение на барже не позволяет молодым рыбам узнавать важные экологические сигналы в период становления их молоди. По словам Кифера, баржа может преодолеть такое же расстояние за два-три дня, что обычно занимает несколько недель. Путешествие на большие расстояния на лодке – в этом исследовании – не менее 215 миль – похоже, искажает естественные сигналы, которые эти рыбы используют, чтобы найти дорогу домой. Результаты Кифера также предполагают, что перевозимая рыба с большей вероятностью отклонится от родного притока.Если эта потерянная рыба – часто из заводских популяций – размножается с другой дикой популяцией, результирующий поток генов может снизить эволюционную пригодность этой популяции.

«История жизни лосося представляет собой долгое наследие адаптации к местным условиям», – говорит Кифер. «Рыбы хорошо приспособлены к конкретным рекам, и если разбавить их уникальный генетический состав, это может снизить продуктивность всей популяции».

По словам Кифера, трудно найти удовлетворительное решение.Управляющие могут выгружать меньше молоди, но тогда больше рыбы погибнет при попытке пройти через плотины. Они также могли бы сбрасывать больше воды через водосбросы плотин, чтобы помочь молоди пройти вниз по течению, но это уменьшило бы количество энергии, производимой плотинами. Третий вариант – замедлить движение барж, чтобы поездка напоминала время, необходимое молодым людям, чтобы доплыть до океана. Но лодки представляют собой стрессовую среду для рыб, а близкое расположение судов увеличивает риск заболеваний.

«Трудно найти решение, которое могло бы справиться со всеми проблемами в этой системе», – говорит Кифер.Ученые и менеджеры по выращиванию лосося надеются найти идеальное решение: такое, которое сохранит местные популяции рыб и максимизирует их выживание при сохранении целостности энергопроизводящих плотин.

###

Чтобы получить доступ к изображениям, связанным с этой статьей, свяжитесь с Кристин Бакли по адресу [email protected] или по телефону (202) 833-8773 доб. 211.

Экологическое общество Америки – крупнейшая в мире профессиональная организация экологов, представляющая 10 000 ученых в Соединенных Штатах и ​​по всему миру.С момента своего основания в 1915 году ЕКА продвигает ответственное применение экологических принципов к решению экологических проблем с помощью отчетов, журналов, исследований и экспертных заключений Конгресса ЕКА. ЕКА издает четыре журнала и ежегодно созывает научную конференцию. Посетите веб-сайт ESA http://www.esa.org.

Журнал

Экологические приложения

Заявление об отказе от ответственности: AAAS и EurekAlert! не несут ответственности за точность выпусков новостей, размещенных на EurekAlert! участвующими учреждениями или для использования любой информации через систему EurekAlert.

Упс, похоже, что-то пошло не так.

/home/istanbulhairline/storage/framework/views/b5319231b18c8aa907b8da682ed49ca01fee2670.php ‘, массив (‘ __env ‘=> объект ( Factory ),’ app ‘=>20) объект 9057 ‘=> объект ( ViewErrorBag ),’ dil ‘=> объект ( Коллекция ),’ dils ‘=> null ,’ menu ‘=> объект ( Коллекция ),’ ceviriler ‘=> объект ( Коллекция ),’ sayfa ‘=> null ,’ hizmetler ‘=> объект ( Коллекция ),’ rehber ‘=> объект ( Коллекция ), ‘hizmet’ => объект ( Коллекция ), ‘kvkk’ => объект t ( Sayfa ), ‘sacekimi’ => объект ( Sayfa ), ‘iletisim’ => объект ( IletisimAyarlari ), ‘hakkimizda’ => объект Sayfa 92fa6 (8) ‘sosyal’ => объект ( Sosyal ), ‘blog’ => объект ( LengthAwarePaginator ))) в CompilerEngine.php line 59 at View -> render () в Response.php line 38 на Ответ -> __ construct ( объект ( View )) в маршрутизаторе .php строка 615 Router -> Освещение \ Маршрутизация \ {закрытие} ( объект ( Запрос )) в строке Pipeline.php 30 -> Освещение \ Конвейер \ {закрытие} ( объект ( Запрос )) в Pipeline.php строка 53 line 148 -> Освещение \ Конвейер \ {закрытие} ( объект ( Запрос )) в Pipeline.php строка 53 line 148 -> Освещение \ Конвейер \ {закрытие} ( объект ( Запрос )) в Pipeline.php строка 53 -> Освещение \ Конвейер \ {закрытие} ( объект ( Запрос )) в Pipeline.php строка 536 Pipeline -16 > Освещение \ Routing \ {closure} ( объект ( Запрос )) в TransformsRequest.php строка 3092 Запрос ), объект (92 Запрос ), объект Замыкание )) в трубопроводе .php line 1487), Замыкание )) в трубопроводе .php line 148
в Collection.php строка 1563
в HandleExceptions -> handleError (8, ‘Undefined offset: 0’, ‘/ home / istanbulhairline / vendor / laravel / framework / src / Illuminate / Support / Collection.php ‘, 1563, массив (‘ key ‘=> 0)) в Collection.php строка 1563
в Collection -> offsetGet (0) в b5319231b18c8aa907b8da682ed49ca01.php line 16
at include (‘/ home / istanbulhairline / storage / framework / views / b5319231b18c8aa907b8da682ed49ca01fee2670.php’) в PhpEngine.php line 42

6
at CompilerEngine -> get (‘/ home / istanbulhairline / resources / views / tema / alt.blade.php’, array (‘__env’ => object ( Factory ), ‘app’ => объект ( Приложение ), ‘errors’ => объект ( ViewErrorBag ), ‘dil’ => объект ( Коллекция ), ‘dils’ => null , ‘menu’ => объект ( Collection ), ‘ceviriler’ => object ( Collection ), ‘sayfa’ => null , ‘hizmetler’ => объект ( Коллекция ), ‘rehber’ => объект ( Коллекция ), ‘hizmet’ => объект ( Коллекция ), ‘kvkk’ => объект ( Sayfa ), ‘sacekimi’ => объект ( Sayfa ), ‘iletisim’ => object ( IletisimAyarlari ), ‘hakkimizda’ => объект ( Sayfa ), ‘ sosyal ‘=> объект ( Sosyal ),’ blog ‘=> объект ( LengthAwarePaginator ))) в представлении .php line 137
at View -> getContents () в View.php line 120
at View -> renderContents () в View.php line 85
at Response -> setContent ( object ( View )) в Response.php line 206
at Router -> prepareResponse ( объект ( Request ), объект ( View )) в Router.php line 572
в Конвейер -> Освещение \ Маршрутизация \ {закрытие} ( объект ( Запрос )) в SubstituteBindings.php line 41
at SubstituteBindings -> handle ( object ( Request ), object ( Closure )) в Pipeline.php line 148
на Конвейер -> Освещение \ Маршрутизация \ {закрытие} ( объект ( Запрос )) в VerifyCsrfToken.php line 65
at VerifyCsrfToken -> handle ( object ( Request ), object ( Closure )) в Pipeline.php line 148
на Конвейер -> Освещение \ Маршрутизация \ {закрытие} ( объект ( Запрос )) в ShareErrorsFromSession.php line 49
at ShareErrorsFromSession -> handle ( object ( Request ), object ( Closure )) в Pipeline.php line 148
на Конвейер -> Освещение \ Маршрутизация \ {закрытие} ( объект ( Запрос )) в StartSession.php line 64
at StartSession -> handle ( object ( Request ), object ( Closure )) в Pipeline.php line 148
at 9 -> Освещение \ Конвейер \ {закрытие} ( объект ( Запрос )) в Pipeline.php строка 53
на Конвейер -> Освещение \ Маршрутизация \ {закрытие} ( объект ( Запрос )) в AddQueuedCookiesToResponse.php line 37
at AddQueuedCookiesToResponse -> handle ( object ( Request ), object ( Closure )) в Pipeline.php line 148

-> Освещение \ Конвейер \ {закрытие} ( объект ( Запрос )) в Pipeline.php строка 53

на Конвейер -> Освещение \ Маршрутизация \ {закрытие} ( объект ( Запрос )) в EncryptCookies.php line 59
at EncryptCookies -> handle ( object ( Request ), object ( Closure )) в Pipeline.php pipe 148
на Конвейер -> Освещение \ Маршрутизация \ {закрытие} ( объект ( Запрос )) в конвейере .php line 102
at Pipeline -> then ( object ( Closure )) in Router.php line 574
at Router -> runRouteWithin Маршрут ), объект ( Запрос )) в Router.php строка 533
на Маршрутизатор -> dispatchToRoute ( объект ( Запрос )) в Router.php
на Маршрутизатор -> отправка ( объект ( Запрос )) в ядре .php line 176
at Kernel -> Illuminate \ Foundation \ Http \ {closure} ( object ( Request )) в Pipeline.php line 30
at
в TransformsRequest -> handle ( объект ( 906 объект 68), ( Закрытие )) в трубопроводе .php line 148
at Pipeline -> Illuminate \ Pipeline \ {closure} ( object ( Request )) в Pipeline.php line 53
at Pipeline \ Routing \ {closure} ( объект ( Запрос )) в TransformsRequest.php строка 30
в TransformsRequest -> handle ( объект (
at Pipeline -> Illuminate \ Pipeline \ {closure} ( object ( Request )) в Pipeline.php line 53
at Pipeline \ Routing \ {closure} ( объект ( Запрос )) в ValidatePostSize.php строка 27
в ValidatePostSize -> дескриптор ( объект ( запрос ), объект Замыкание )) в трубопроводе .php line 148
at Pipeline -> Illuminate \ Pipeline \ {closure} ( object ( Request )) в Pipeline.php line 53
at Pipeline \ Routing \ {closure} ( объект ( Запрос )) в CheckForMainastedMode.php строка 46
в CheckForMain maintenanceMode -> дескриптор ( объект ( объект 923
at Pipeline -> Illuminate \ Pipeline \ {closure} ( object ( Request )) в Pipeline.php line 53
at Pipeline \ Routing \ {closure} ( object ( Request )) в Pipeline.php line 102
at Pipeline -> then ( object ( Closure )) in Kernel.php строка 151
at Kernel -> sendRequestThroughRouter ( object ( Request )) в ядре .php line 116
at Kernel -> handle ( object ( Request )) in index.php line 59

Параметры процесса, микроструктура и механические свойства

Аддитивное производство ( AM) для изготовления 3D металлических деталей в последнее время привлекает большое внимание. Среди новых технологий AM – ультразвуковое аддитивное производство (UAM) или ультразвуковое уплотнение (UC), при котором ультразвуковые колебания используются для склеивания схожих или разнородных материалов для создания трехмерных конструкций.Эта технология имеет несколько конкурентных преимуществ по сравнению с другими технологиями AM, которые включают изготовление разнородных материалов и сложных форм, более высокую скорость осаждения и изготовление при более низких температурах, что не приводит к превращению материала во время обработки. Хотя оптимизация процесса UAM и микроструктура описаны в литературе, все еще отсутствует стандартизированное и удовлетворительное понимание механических свойств конструкций UAM. Это можно объяснить структурными дефектами, связанными с обработкой UAM.В этой статье обсуждается влияние параметров процесса UAM на результирующую микроструктуру и механические свойства. Особое внимание уделяется измерениям твердости, прочности на сдвиг, прочности на разрыв, усталости и ползучести. Кроме того, были рассмотрены тесты на вытягивание, выталкивание и нажимной штифт, обычно используемые для определения качества и прочности соединения. Наконец, были рассмотрены текущие проблемы и недостатки процесса и потенциальных приложений.

1. Введение

Исторически ультразвуковая сварка металлов применялась с 1950-х годов для сварки выводов батарей, тонкой фольги для упаковки и электронных проводов [1].Ультразвуковое аддитивное производство (UAM) или процесс ультразвуковой консолидации (UC) был изобретен и запатентован Даун Уайт [2]. В 1999-2000 годах Уайт основал Solidica Inc. [3] для продажи коммерческих машин UAM. UAM или UC – это твердотельная технология для соединения похожих или разнородных материалов (обычно металлической фольги) при комнатной температуре путем их послойного связывания вместе с помощью ультразвуковых колебаний под давлением для формирования трехмерных готовых деталей [4]. Принцип работы этой технологии прост, и на рисунке 1 показаны компоненты процесса и настройки объединенных коммуникаций.Типичная система UAM состоит из двух ультразвуковых преобразователей (с частотой до 20 кГц каждый), которые передают колебания на сонотрод в форме диска для создания сплошного сварного шва.


На рисунке 2 показаны этапы получения высокопрочного соединения через UAM. Процесс начинается с укладки металлической опорной пластины и прижатия к ней тонкой металлической фольги [1, 5]. Применяются высокочастотные ультразвуковые колебания, чтобы очистить сопрягаемые поверхности, сохраняя при этом постоянную силу [1].Ультразвуковое движение вызывает сдвиг, который очищает поверхность от оксидов посредством трения, обеспечивая прямой контакт металла с металлом. Кроме того, этот процесс сдвига приводит к возникновению динамических межфазных напряжений между контактирующими поверхностями [2]. Пластическая деформация и рекристаллизация на границе раздела соединений приводят к образованию высокопрочной металлургической твердотельной связи [1]. Kong et al. [6] предположили, что механизм этого твердотельного связывания можно разделить на два: во-первых, это объемное связывание, которое связано с упругой и пластической деформацией из-за акустического и термического размягчения [7].Микроструктурный анализ показал, что пластическая деформация играет важную роль в облегчении начала связывания [8, 9]. Во-вторых, это поверхностное связывание, которое связано с межфазным трением и сдвигом, разрушающим оксидные слои [10]. УАМ работает при температурах намного ниже температуры плавления исходных материалов, обычно 0,3–0,5 Тм. Избегают плавления и устраняют пустоты / дефекты, связанные с высокой температурой [11]. Благодаря этому атрибуту становится возможным склеивание разнородных материалов, и сохраняются боевые свойства каждого здания.Подобные и разнородные конструкции с использованием UAM, такие как Al-Al [10, 12–15], Al-Ti [16], Al-NiTi [17], Al-SiC [18, 19], Al со встроенными диэлектрическими материалами (используются чернила) в индустрии печатной электроники) [20], низкоуглеродистая сталь [21, 22] и алюминиевый сплав с памятью формы (SMA) [23] до сих пор описаны в литературе.


Подобно другим процессам аддитивного производства, процесс UAM сопровождается периодической механической обработкой для получения окончательной геометрии. Однако требуется лишь небольшая обработка, поскольку UAM обеспечивает построение формы, близкой к конечной.По этой причине UAM иногда называют гибридным аддитивным / основным производством [24]. По сравнению с традиционной обработкой с ЧПУ из-за обработки после UAM образуется лишь небольшое количество отходов или брака. На рисунке 3 показана разница между традиционной обработкой с ЧПУ, которая начинается с большого ящика, и UAM, которая начинается с тонкого металлического листа и заканчивается небольшим количеством брака или его отсутствием. Чтобы сравнить UAM с другими методами AM, в следующем разделе обсуждаются конкурентные преимущества UAM по сравнению с другими процессами AM.


2. UAM
в сравнении с Другие технологии AM

UAM как твердотельный процесс имеет несколько преимуществ по сравнению с другими доступными технологиями AM. Например, для большинства процессов AM требуется определенный уровень фазового превращения материала, начиная с исходного сырья и заканчивая геометрией, близкой к конечной [3]. Это ограничивает диапазон материалов, которые можно наносить. По сравнению с UAM, осаждение слоев достигается с помощью твердотельного соединения. Металлургические связи между слоями достигаются с помощью ультразвука без образования расплавленного металла на границе раздела [3], и это позволяет наносить широкий спектр похожих и разнородных материалов.Кроме того, UAM имеет более высокую скорость осаждения по сравнению с другими процессами AM из-за более низкого тепловложения на осаждаемый объем и более быстрого рассеивания тепла [3, 25]. Благодаря твердотельному соединению в UAM, остаточные напряжения и деформации значительно снижаются по сравнению с прямым осаждением металла, которое включает преобразование жидкость-твердое тело. Высокие остаточные напряжения являются результатом быстрого термического цикла нагрев-охлаждение во время обработки [26]. В идеальном процессе AM поле напряжений намного сложнее из-за количества и характера источников тепла и теплопередачи.Для деталей из AM высокие остаточные напряжения при растяжении обычно возникают на поверхности металлической конструкции, что может повлиять на механические свойства. Влияние этих напряжений можно смягчить с помощью методов в процессе или постпроцессе [26]. С точки зрения приложений, сложные геометрические формы, такие как внутренние каналы и пустоты, могут быть изготовлены с использованием UAM. Это было исследовано для таких приложений, как 3D-каналы для микроканального охлаждения и охлаждающие каналы для пресс-форм. Кроме того, во время обработки UAM можно прервать процесс сборки и выполнить последующую обработку [24].Это крайне сложно при использовании других технологий изготовления. Еще один ключевой контраст между UAM и другими технологиями – это внедрение таких материалов, как оптические волокна, в металлические компоненты. Например, Ли и Соар успешно сообщили о внедрении SiC-волокон и одномодовых (SM) оптических волокон в матрицы Al3003 и Al6061 [27]. Это невозможно с другими методами AM из-за высокой температуры во время обработки. Стоит отметить, что достижение этих преимуществ с помощью UAM требует понимания различных параметров процесса и их влияния на получаемые микроструктуры и свойства.В следующем разделе освещаются некоторые важные параметры процесса UAM.

3. Параметры процесса UAM

Формирование высокопрочного и качественного соединения во время процесса UC зависит от используемых параметров процесса. Среди наиболее важных параметров процесса – нормальная сила (Н), амплитуда ( мкм м), скорость (мм / с) и температура (° C). Важным компонентом, влияющим на эти параметры процесса, является сонотрод, который вступает в прямой контакт с материалами и обеспечивает необходимую энергию для соединения [24].Он обеспечивает равномерную нагрузку и вибрацию деталей, соединенных ультразвуком. Сонотроды обычно изготавливаются из титана, алюминия или стали с различной обработкой поверхности и предназначены для различных применений. Например, сонотрод из стали имеет среднюю шероховатость поверхности (Ra) 5,2 мкм м [20] и используется для приложений с низкой амплитудой, где требуется твердость. Чаще всего используется титан из-за низкой потери вибрации и высокой прочности, в то время как алюминий, который обычно покрыт хромом или никелем, используется для уменьшения износа [24].Наиболее важные переменные параметры UAM обсуждаются ниже.

3.1. Нормальная сила (Н)

Нормальная сила, иногда называемая «давлением», – это направленная вниз сила, прикладываемая сонотродом к сопрягаемым поверхностям, и может варьироваться от 100 Н до 9000 Н в зависимости от материалов конструкции. Эта постоянная сила обеспечивает тесный контакт между строительными материалами во время обработки и способствует пластическому течению [8]. Синергия между силой и ультразвуковыми колебаниями создает динамические напряжения, которые необходимы для удаления оксидов и пластического течения [8].Фрил и Харрис [28] заявили, что чем выше давление, тем больше площадь связывания, что приводит к меньшему объему пустот. В зависимости от материала слишком высокое давление приведет к большему уровню деформации и чрезмерным напряжениям [6, 29]. Следовательно, слишком низкое давление вызовет недостаточную деформацию и контакт между строительными материалами, что приведет к слабой связи. Следовательно, для качественного склеивания без пустот или с минимальным количеством пустот необходимо оптимальное усилие (давление).

3.2. Амплитуда (
мкм м)

Амплитуда, которая обычно может находиться в диапазоне от 10 до 50 мкм м, представляет собой продольное колебательное смещение сонотрода, которое контролирует толщину границы раздела, плотность склеенной области и размер деформированного площадь [30]. Пауэрс и Джонс [31] заявили, что амплитуда определяет величину пластической деформации строительных материалов. Кроме того, чем выше амплитуда, тем выше энергия, генерируемая на границе раздела строительного материала [14, 23, 32], что приводит к лучшему качеству и прочности склеивания.Однако чрезвычайно высокая амплитуда приводит к разрыву уже сформированных связей из-за чрезмерных напряжений.

3.3. Скорость (м / с)

Скорость – это движение сонотрода по заготовке во время обработки и может варьироваться от 1 мм / с до 100 мм / с [20]. Скорость определяет продолжительность времени, в течение которого материал под сонотродом будет подвергаться сжатию и колебаниям [24]. Кроме того, энергия, передаваемая заготовке, обратно пропорциональна используемой скорости. Например, Kong et al.[33] заявили, что при заданной контактной силе и амплитуде уменьшение скорости (с 38,8 до 27,8 мм / с) увеличивает энергию материала конструкции, что приводит к более высокому уровню деформационного упрочнения. Однако в другой работе Kong et al. [34], они показали отсутствие достаточного сцепления при увеличении скорости с 34,5 до 43,5 мм / с.

3.4. Температура (° C)

Температура субстрата – еще один параметр процесса, который может повлиять на качество склеивания, как сообщают различные исследователи [14, 17, 29, 35, 36].Во время обработки температура подложки / детали может быть увеличена по сравнению с условиями окружающей среды. Джордж и Стакер [37] отметили, что использование более высокой температуры во время обработки приводит к более плотным и прочным связям. Это повышение температуры зависит от материалов конструкции, и необходим тщательный выбор, особенно для разнородных материалов. В таблице 1 приведены типичные параметры процесса, используемые разными авторами для создания различных материалов. Из таблицы 1 можно сказать, что выбор параметров процесса зависит от материала (материалов) конструкции.Например, более низкая температура подложки выбирается при создании SMA NiTi с алюминием [17], тогда как более высокая температура подложки выбирается для создания подобных материалов, таких как сталь 4130 [21]. Как упоминалось ранее, энергия, передаваемая заготовке, регулируется также путем изменения других параметров процесса.

[39]

Cu -h28

75 [36] ]
Строительный материал Сила (Н) Скорость (мм / с) Амплитуда ( μ м) Температура основания (90 ° C) 9060 с.
Al2024 2500 46 24 120 [35]
Al3003 O / Al3003-h60 14003-h60 [38]
Al3003-h28 / Al1050-h24 1600 20 25 – [20]
Al3003 / Al3003-h28 9060–60195

05 40

 10–19 24–149 [5]
Al3003-h28 / Al3003-h24 600–1000 18–26 42–64 149

 [
Al1100-O / CP Ti 3500 25.4 41,55 200 ° F [39]
Al3003-h28 / CP Ti 1750–2000 10,58–23,70 16–28 300 ° F
Al6061-h28 5000 85 35 75 [13]
Al3003-h28 5600 35,6 26 – 26 – NiTi / Al6061 6000 84.6 32,76 22 [17]
NiTi SMA / Al3003-h28 138 кПа ≤34,5 8,4–14,3 –
6700 30 36 25 [36]
SiC / Al3003 1400–2000 25–42 10–20
Al6061-h28 5000 84.7 35 75 [15]
4130 Сталь 6000 21 30,87 204 [21]
во время обработки зависит от качества образующейся связи и может быть определено количественно с использованием подхода линейной плотности сварного шва (LWD) [12, 42]. LWD – это длина конкретного интерфейса, который кажется связанным, деленный на общую длину проверяемого интерфейса [12], как показано в уравнении (1).Длина связанного интерфейса относится к фактической длине, тогда как общая длина интерфейса относится к измеренной кажущейся длине.

Для обеспечения качества соединения звука LWD должен быть как можно выше. Обычно детали UAM имеют LWD от 45 до 95% [12]. Более низкие значения связаны с более низкими энергиями UAM, которые создают более слабые связи [42]. Такие параметры, как скорость, амплитуда, температура подложки и нормальная сила были связаны с LWD [5]. Например, Джанаки Рам и др.[5] исследовали влияние параметров процесса на образование связи Al3003 во время UC. Используя план экспериментов (DoE), они [5] получили оптимальную комбинацию параметров на основе предварительных экспериментов, пределов настройки машины и имеющихся литературных данных. Было рассмотрено четыре параметра процесса, варьируемых на четырех различных уровнях, как показано в таблице 2. Ортогональная матрица Taguchi L16, показанная в таблице 3, использовалась для определения влияния каждого параметра процесса, и было проведено в общей сложности 16 экспериментальных прогонов.

itude 929

90pl606 A Сила (0
Параметр Метка Уровень 1 Уровень 2 Уровень 3 Уровень 4
10 13 16 19
Скорость (мм / с) B 28 32 36 40
1450 1600 1750 1900
Температура (° C) D 24 66 107 149
9 0604 3
Ход # A B C D% LWD
1 1 1 1 1 18
2 3 4 2 4 2 3 1 67
4 2 3 4 1 25
5 3 2 32
6 4 1 4 2 76
7 1 2 2 2 2 2 2 2 3 3 1 2 55
9 2 1 2 3 60
10 1 3 3 3 50
11 4 4 1 3 36
12 12 12 57
13 4 3 2 4 70
14 3 1 3 4 На основе в Taguchi DoE они [5] сохранили один фактор как фиксированный, а остальные три параметра изменили.Например, для каждого значения амплитуды используются три набора других параметров (скорость, сила и температура), как показано в таблицах 2 и 3. Однако результаты% LWD были представлены в [5] как среднее значение измеренных значений. при различных параметрах, как показано символом пустого квадрата на рисунках 4 (a) и 4 (b). К сожалению, это может вводить в заблуждение, поскольку средние значения не являются репрезентативными для данных, полученных в этих экспериментах, как это видно на рисунках с 4 (a) по 4 (d). На этих рисунках фактические данные для 16 экспериментов были получены от Yang et al.[43]. В нашей статье был проведен статистический анализ, который обсуждается ниже. Опираясь на средние значения, Janaki Ram et al. [5] объяснили изменения в% LWD изменением одного параметра, например, заявив, что увеличение амплитуды с 10 до 16 мкм м увеличивает% LWD. Однако этого нельзя сделать на основании данных, представленных на рисунках 4 (a) –4 (d). Тем не менее, поскольку их работа [5] основана на DoE Тагучи, из результатов можно получить различную информацию, как обсуждается ниже.

Используя доступные данные из [43], процентный вклад каждого параметра процесса был рассчитан, как показано на рисунке 4 (e). Видно, что наибольший вклад вносила амплитуда, за которой следует температура. Сила имела наименьший вклад, что составляет половину вклада температуры. Также было оценено среднее значение отношения сигнал / шум ( S / N ). Поскольку желателен более высокий% LWD, для этого анализа был выбран вариант больше, тем лучше, и результаты представлены на Рисунке 4 (f).Аналогично процентному вкладу, амплитуда показала самое высокое отношение сигнал / шум между 30 и 36 дБ (Δ = 6), за которым следовала температура, которое имело отношение сигнал / шум между 31 и 36 дБ (Δ = 5). Скорость имела наименьшее соотношение сигнал / шум от 32 до 34 дБ (Δ = 2). Это означает, что при отнесении изменений% LWD к какому-либо параметру эти средние вклады необходимо учитывать. Например, когда авторы [5] упомянули, что увеличение температуры подложки увеличивает LWD, вклад амплитуды в это увеличение намного выше, чем вклад температуры.Поэтому его нельзя отнести только к скорости, представленной в [5]. То же самое касается других параметров, даже для эффекта амплитуды, потому что в этом случае влияние изменения других параметров составляет около 60% при изменении% LWD.

Как и ожидалось, на результирующую микроструктуру и механические свойства будут влиять параметры процесса UAM. По этой причине значительная часть литературы по UAM уделяет больше внимания оптимизации параметров процесса [29, 34, 40, 44] и микроструктурному анализу [12, 22, 28, 45, 46] исполнительной части. .Микроструктурный анализ дает существенную информацию о механизме связывания, измельчении зерна и дефектах, которые освещаются в следующем разделе. На сегодняшний день обширные и общепринятые механические свойства и процедуры определения характеристик печатных деталей UAM не могут быть найдены в литературе. Несмотря на то, что сообщалось о таких свойствах, как микро / нанотвердость, прочность (на сдвиг и растяжение) и усталостное поведение, необходимы дополнительные исследования, чтобы полностью понять механические свойства конструкций UAM.Более подробно это обсуждается в разделе 5 этой статьи.

4. Микроструктура

Принимая во внимание тот факт, что нет никаких преобразований материала, связанных с UAM, можно ожидать, что составляющие материалы сохранят свои свойства и микроструктуру. По этой причине большая часть литературы, касающейся микроструктуры конструкций UAM, сосредоточена на границе раздела между связями. Кроме того, можно утверждать, что в микроструктуре будет существовать неоднородность, особенно в местах соединений.Таким образом, чтобы понять качество соединения и механизм сборки UAM, микроструктурное исследование имеет первостепенное значение. Это помогает понять фундаментальные процессы во время UAM. Например, Fujii et al. [47] наблюдали микроструктуры несвязанных и связанных интерфейсов Al6061, построенных с помощью светлопольного ПЭМ, как показано на рисунке 5.

Рисунок 5 (a) показывает неровности, которые находятся в прямом физическом контакте между верхней и нижней поверхностями строительные материалы. Эти микровыступы деформируются при сжатии путем приложения нагрузки (силы), что, следовательно, приводит к образованию микровыступов, как показано на рисунке 5 (b).Во время образования микробонд, неровности размягчаются и разрушаются под действием высокоскоростной деформации из-за ультразвуковых колебаний [47]. При непрерывном размягчении и измельчении на поверхности раздела образуются значительные количества микробов, как показано на Рисунке 5 (c). Некоторое количество оксидных пленок все еще видно, но рассредоточено по границе раздела из-за трения и пластического течения. Благодаря диспергированию оксидных пленок достигается прямой контакт между сопрягаемыми поверхностями, и образуются полные металлургические связи, как показано на рисунке 5 (d).Наконец, они [47] сообщили, что первоначально удлиненные зерна были заменены недавно развитыми мелкими равноосными зернами. Sriraman et al. [36] также наблюдали образование равноосных зерен в медной сборке. Они [36] показали, что относительно крупный размер зерна 25 мкм мкм в фольге в исходном состоянии уменьшается до более мелкого и более однородного размера зерна от 0,3 до 10 мкм мкм. Более мелкие зерна возникают из-за рекристаллизации и движения границ зерен через поверхность раздела [36].

Наличие пустот на границе раздела – одна из наиболее часто упоминаемых характеристик, которая определяет частично или полностью связанный интерфейс. Например, Hopkins et al. [14] наблюдали пустоты на границе раздела структуры Al3003, как показано на рисунке 6. Они [14] сообщили, что на границе раздела наблюдались три отличительные особенности: области с большими пустотами, области с небольшими трещиноподобными пустотами и частичным сцеплением, и области, где нет видимых пустот, которые считаются полностью связанными.


Janaki Ram et al. [5] также классифицировали эти пустоты (дефекты), наблюдаемые в встраивании Al3003, по трем различным морфологиям, как показано на рисунке 7. Это линейные дефекты, параболические дефекты и точечные дефекты, которые обозначены как D1, D2 и D3 на рисунке 7. Они [5] связали наличие этих дефектов с параметрами обработки UAM. Линейные дефекты наблюдались в образцах с очень низким% LWD, нанесенных с использованием малой амплитуды и / или нормальной силы. Параболические дефекты связаны со средним или средним или высоким уровнем плотности сварного шва, тогда как точечные дефекты наблюдались с образцами с очень высоким уровнем плотности сварного шва [5].Аналогичные наблюдения были зарегистрированы для деталей из стали / стали из Al6061-h28 [13] и 4130 [21].


Обычно наличие этих пустот (линейных, точечных и параболических) связано с сонотродом, который катится по нескольким слоям [5, 12, 32, 46]. Например, первый слой, прикрепленный к подложке, обычно оставляет шероховатую поверхность из-за движения сонотрода [5]. Следующий наносимый слой имеет относительно плоское дно (гладкую поверхность), которое соприкасается с шероховатой поверхностью первого слоя.Это создает несоответствие между гладкой и шероховатой поверхностями и приводит к слабым связям с множеством пустот [5]. Аналогичное объяснение было дано Levy et al. [21], где они объяснили дефекты присутствием оксидов на поверхности фольги и шероховатой верхней поверхностью. На этом этапе можно было бы предположить, что сборки UAM не свободны от дефектов, и требуется дополнительная работа для изготовления бездефектных сборок или, по крайней мере, уменьшения образования пустот. Для решения проблемы пустот во время обработки применялась постобработка, такая как термообработка с использованием искрового плазменного спекания (SPS) [11, 21, 39, 48] и горячего изостатического пресса (HIP) [11, 21].Например, Леви и др. [21] использовали как SPS, так и HIP, чтобы минимизировать множественные дефекты, наблюдаемые в конструкции сталь / сталь 4130. На рис. 8 показаны микрофотографии, полученные с помощью SEM, поперечного сечения конструкции из стали 4130 до и после SPS. Из рисунков 8 (a) и 8 (b) можно увидеть, что в исходном состоянии имелись разрывы и большое количество дефектов. После обработки SPS (рисунки 8 (c) и 8 (d)) образцы показали относительно небольшие неоднородности и небольшие округлые пустоты. SPS также показал меньше пустот по сравнению с HIP, у которого были большие несплошности.Это указывает на то, что необходима дополнительная обработка конструкций UAM, чтобы избежать значительной потери свойств материала из-за наличия пустот. Использование других методов, таких как микроволновое спекание, может дать интересные результаты, поскольку микроволновое излучение успешно используется для производства полностью плотных материалов, подобных SPS [49]. Следует тщательно выбирать оптимальные параметры термообработки, чтобы избежать роста зерен вблизи границы раздела склеивания. Кроме того, дополнительная обработка разнородных материалов может быть проблемой при разных температурах, особенно если каждый материал по-разному реагирует с температурой.Здесь необходимы более фундаментальные исследования для решения этой проблемы.


5. Механические свойства

Поскольку UAM или UC производят трехмерные изделия путем добавления тонких слоев (толщиной около 0,125 мм) один поверх другого путем соединения их с помощью ультразвуковой вибрации, механические свойства готовой продукции детали будут зависеть от качества и характеристик интерфейса между слоями. Межфазное соединение обычно происходит между металлической фольгой / лентами [12], где контакт металл-металл под давлением приводит к пластической деформации, диспергированию оксидов и разрушению неровностей [21].Для улучшения механических свойств первостепенное значение имеет прочное непрерывное межфазное соединение [21]. Различные уровни свойств могут быть достигнуты путем тщательного выбора параметров обработки. Изменение механических свойств готовых деталей UAM зависит от материалов, направления строительства, постобработки и наличия пустот / дефектов. Как упоминалось в разделе 4, дефекты в готовых частях UAM обычно находятся на границе раздела между слоями. Отсутствие сцепления [12] и сплавление [50] – это внутренние дефекты, которые классифицируются как наиболее распространенные дефекты, влияющие на свойства конструкции.Эти дефекты отрицательно сказываются на механических свойствах готовых деталей. Они снижают несущую способность и создают концентрацию напряжений в непосредственной близости от дефекта.

Шероховатость или шероховатость поверхности, которая служит предпочтительным местом для зарождения и распространения трещин [51], существенно влияет на свойства поверхности готовых деталей. Очевидно, что гладкая поверхность дает лучшие усталостные свойства по сравнению с шероховатой поверхностью [50, 51]. В аддитивном производстве детали обычно страдают от плохого качества поверхности (шероховатая поверхность), что ограничивает их усталостные характеристики / характеристики [52].Направление строительства – еще один фактор, который существенно влияет на механические свойства готовой детали UAM. Такие свойства, как твердость и прочность, были зарегистрированы в направлениях X -, Y или в поперечном / продольном направлениях [12] и в направлении Z (направление строительства). Например, эксплуатационная прочность UAM значительно снижается при нагрузке перпендикулярно направлению Z , что объясняется наличием дефектов [13, 53].Направления X, и Y показали относительно похожие свойства [13], и иногда эти направления используются взаимозаменяемо [15]. Производство повторяемых и прочных соединений по-прежнему является проблемой для UAM [21]. Таким образом, необходимость улучшения механических свойств этих соединений является первостепенной. Было обнаружено, что постобработка (постобработка) улучшает механические свойства и структурную однородность [21] готовых деталей UAM, и ей было уделено значительное внимание [11, 13, 39, 48, 53].Постобработка (обработка) с использованием искрового плазменного спекания [11, 21, 39, 48], горячего изостатического прессования [11, 21], а также растворения и старения [13] были изучены до сих пор. Эти последующие обработки устраняют дефекты интерфейса, улучшая механические свойства [21]. Такие свойства, как твердость, прочность на сдвиг и разрыв, а также усталость конструкций UAM, обсуждаются в следующих разделах.

5.1. Твердость

Твердость – одно из важных свойств готовых деталей из UAM. На это свойство существенно влияют параметры процесса, постобработка и микроструктура (измельчение зерна).Например, известно, что тонкая микроструктура обычно связана с увеличением твердости. Как упоминалось ранее, это происходит из-за пластической деформации, возникающей во время процесса UAM, которая улучшает микроструктуру в области интерфейса. Например, Schick et al. [12] сообщили о микротвердости готового UAM Al3003, который был изготовлен с использованием как ленты (h28, 150 мкм, толщина м, ширина 25,4 мм), так и подложки (h24, пластина толщиной более 12,7 мм). При нагрузке 25 г и времени выдержки 13 с средняя микротвердость фольги UAM увеличилась почти на 15% с 64.5 ± 2,7 HV для исходных фольг до 73,7 ± 1,9 HV для заводских. Это было связано с измененной микроструктурой. Подобные наблюдения были упомянуты в работе Ли и Соара [27], где они успешно внедрили SiC-волокна и одномодовые (SM) оптические волокна в матрицы Al3003 и Al6061 с помощью ультразвуковой консолидации. Их результаты [27] показали, что процесс UC увеличивает твердость матриц сплава, особенно в областях, близких к волокнам. Эффект деформационного упрочнения подчинялся соотношению Холла – Петча как для зерен, так и для субзерен.Ли и др. [20] изучали возможность внедрения электрических материалов (чернил, широко используемых в электронной промышленности) в металлические матрицы с помощью UAM. Для создания металлической матрицы Al3003 толщиной 100 мкм м был приварен к Al1050-h24 толщиной 5 мм. Три различных диэлектрических материала (коммерческие чернила, LuxPrint® 8153 от DuPont ™, паяльная маска серии 520 от Technic и Imagecure® AQ XV501T-4 от Sunchemical®) были внедрены в алюминиевые металлические матрицы, изготовленные UAM, и влияние этих диэлектрических материалов о твердости по Кнупу.После печати они [20] продемонстрировали твердость по Кнупу 12,1 HK / 0,01 кг, 23,0 HK / 0,01 кг и 27,3 HK / 0,01 кг для диэлектрических пленок серий 8153, XV501T-4 и 520 соответственно. Более того, они [20] указали, что изменение толщины диэлектрика не оказывает значительного влияния на твердость по Кнупу. Например, диэлектрическая пленка 8153 толщиной 43, 45, 48, 50 и 54 мкм м не показала существенных различий в микротвердости по Кнупу. Можно сказать, что изменение толщины (для диэлектрической пленки 8153) находится в пределах небольшого запаса; однако толщина в диапазоне миллиметров может существенно отличаться.

О влиянии постобработки / обработки на твердость также сообщалось в литературе. Например, Леви и др. [21] изучали пригодность производства низколегированной углеродистой стали с использованием UAM и влияние дополнительной обработки на ее свойства. Последующие обработки SPS и HIP были проведены после изготовления, и была указана микротвердость в исходных условиях, в условиях, обработанных SPS и HIP. В заводском исполнении средняя твердость составила 206 ± 20 HV, а твердость HIP – 153 ± 9 HV.SPS показал изменение микротвердости по направлению (высоте) Z от 159 до 443 HV, как показано на рисунке 9.


Обычно термическая обработка улучшает твердость, но HIP показывает противоположную тенденцию. Это могло быть связано с длительным временем нагрева, что привело к значительному росту зерна, что привело к снижению твердости. SPS показал более высокую твердость, что можно объяснить малым временем нагрева и сохранением структуры материала [54, 55]. Изменение микротвердости по глубине SPS связано с контактом верхней поверхности образца с графитовым пуансоном, что привело к науглероживанию [21].Необходима дополнительная работа для оптимизации условий постобработки, особенно для процесса HIP. Другие методы нагрева, такие как микроволновое нагревание, могут быть интересны, поскольку они также позволяют получать относительно плотные материалы в контролируемых условиях по сравнению с другими традиционными методами [49].

5.2. Тест на отслаивание

Испытания на отслаивание в первую очередь обеспечивают измерение адгезионной прочности ленты, клея или склеенных поверхностей [12]. Тест на отслаивание – один из методов, используемых для оптимизации параметров процесса соединения лент.Однако эти испытания не обеспечивают объемные механические свойства, необходимые для проектирования деталей UAM. В этом случае необходимо учитывать объемные механические свойства, такие как предел прочности на сдвиг и предел прочности при растяжении после обработки UAM. Несмотря на известные ограничения и возможности тестирования на отслаивание, исследователи по-прежнему используют этот метод для количественной оценки качества сцепления [6, 18, 32–34, 37]. Например, Ли и Соар [18] сообщили о свойствах сопротивления отслаиванию непрерывных SiC-волокон, встроенных в матрицу Al6061-O, посредством ультразвуковой консолидации при комнатной температуре.Они [18] отметили, что после внедрения ≥0,8% объемной доли SiC в матрицу Al прочность на отрыв значительно увеличилась. Например, при объемной доле SiC 2,8%, давлении 155,8 МПа, скорости 34,5 мм / с и амплитуде 12,3 мкм м максимальное усилие отслаивания увеличилось почти на 40% по сравнению с 0% объемной долей SiC. Однако они [18] упомянули, что существует пороговая объемная доля при определенных параметрах, при превышении которых пластическое течение и трение неадекватны, чтобы иметь прочные связи на границах раздела фольга-фольга.Дальнейшие испытания показали, что толщина основного металла не оказывает значительного влияния на сопротивление отслаиванию. Ли и др. [20] сообщили об испытании на отслаивание металлической матрицы из алюминия, залитой тремя различными диэлектрическими материалами (диэлектрические пленки серий 8153, XV501T-4 и 520). Как упоминалось в разделе 5.1, диэлектрическая пленка серии 520 имеет более высокую твердость, чем диэлектрическая пленка 8153 и XV501T-4. Было обнаружено, что чем выше твердость диэлектрического материала, тем выше отслаивающие нагрузки (выше сопротивление деформации).Кроме того, чем выше обработка UAM, такая как нагрузка, скорость и амплитуда, тем выше нагрузка на отслаивание. Амплитуда рассматривается как один из наиболее значимых факторов, влияющих на связывание в UAM [14, 56]. Это наблюдение согласуется с работами Friel et al. [38], Kong et al. [34] и Sriraman et al. [36], где они наблюдали, что отслаивающая нагрузка Al3003-h28 увеличивалась с большей амплитудой. Это было связано с минимальным количеством пустот, связанных с более высокими амплитудами во время обработки, как наблюдали Sojiphan et al.[57]. На прочность на отслаивание существенно влияет наличие пустот, исходящих от сонотрода, как указали Ли и Соар [32]. Эту проблему можно решить, улучшив текстуру сонотрода.

Энергия UAM, вырабатываемая во время обработки, влияет на сопротивление отслаиванию консолидированных деталей. Monahgan et al. [42] заявили, что маломощный UAM не только ограничивает степень пластического течения, но также приводит к более низкому LWD. Здесь образуется более слабое соединение и резко снижается сопротивление / прочность отслаиванию.Однако при высокомощных параметрах UAM возникают высокие контактные давления и амплитуды, которые вызывают пластическое течение, увеличивая LWD и сопротивление отслаиванию. Несмотря на то, что испытание прочности на отрыв дает ценную оценку сцепления из первых рук, требуется дополнительная информация и исследования, чтобы понять улучшенное сопротивление деформации в различных направлениях, а также объемные свойства, такие как прочность на разрыв и сдвиг.

5.3. Испытание на вытягивание

Точная оценка прочности межфазной связи между волокном и матрицей все еще является проблемой.Один из методов, используемых для решения этой проблемы, – это испытание на вытягивание. Как правило, испытание включает вытягивание волокна для достижения начального отсоединения от матрицы с помощью измерителя микротвердости [29], синхронизацию датчика силы и датчика акустической эмиссии (AE) с помощью двухканального цифрового осциллографа, прикрепленного к тестеру [29]. ]. Ключевые особенности и улучшения этой тестовой установки были предложены Хером и Дапино [17]. На рисунке 10 показана типичная кривая вытягивания-смещения.Хер и Дапино [17] изучали прочность на разрыв композитов NiTi-Al UAM. Сообщалось о влиянии различных методов обработки поверхности волокон на прочность на выдергивание. Использовали оксидную, шероховатую, химически протравленную и механически полированную поверхность. Их результаты [17] по вытяжке показали, что нагрузка до разрушения была одинаковой для всех тестируемых условий поверхности. Более того, алюминий наблюдался на поверхности волокна, что указывает на отказ матрицы, а не на повреждение интерфейса.


Kong et al. [23] также использовали вытягивание для характеристики прочности связи волокон из сплава с памятью формы (SMA), внедренных ультразвуком, в матрицу из Al3003. Они [23] показали, что параметры процесса, такие как амплитуда, давление и скорость, имеют значительное влияние на характеристики вытягивания. Например, они [23] наблюдали, что при более высокой амплитуде сопротивление вытягиванию уменьшалось, в то время как увеличение давления не показало какого-либо существенного улучшения силы вытягивания.Кроме того, при скорости 27,8 мм / с амплитуда 6,8 мкм м имела примерно вдвое большую силу отрыва по сравнению с амплитудами 10,4 и 14,3 мкм м. Кроме того, при сравнении 27,8 мм / с и 34,5 мм / с при одинаковых амплитудах 6,8, 10,4 и 14,3 мкм м, 27,8 мм / с имели более высокое усилие отрыва. Это было связано с более длительным временем консолидации, что приводит к более высоким сжимающим силам, прилагаемым к волокну [23]. Приложенная сила всегда постоянна во времени во время UAM; следовательно, нельзя ожидать более высокого уровня сжимающих сил, приложенных к волокну, как объясняется в [23].Вместо этого более длительное время отверждения, связанное с более низкой скоростью, приводит к большему сцеплению, что увеличивает усилие отрыва.

5.4. Испытание на выталкивание

Из-за ограничений испытания на вытягивание при оценке хрупких волокон Маршалл и Оливер [19] предложили испытание на выталкивание, которое также является простым испытанием, которое может быть выполнено с использованием измерителя микротвердости, синхронизированного с датчик акустической эмиссии (AE). В этом методе расслоение вызвано продвижением волокна вдоль его оси под действием постепенно увеличивающейся нагрузки.Ян и др. [29] использовали испытание на выталкивание для оценки прочности связи между волокном SiC и матрицей Al3003, изготовленной с использованием UAM. Пики сигнала АЭ, зарегистрированные во время теста на выталкивание, указывают на расслоение, и наблюдаются нагрузки отсоединения. Они [29] показали, что разрывающие нагрузки были случайными по отношению к различным вариациям параметров. Причина этого не была удовлетворительно указана, что указывает на необходимость более глубокого понимания и исследования.

5.5. Тест «нажимной штифт»

Другим методом оценки механических характеристик клееных или слоистых конструкций является метод «нажимной штифт» [39].Этот метод, предложенный Zhang et al. [58] включает толкание штифта с определенной скоростью при измерении нагрузки и смещения. Максимальная нагрузка и площадь под кривой нагрузка-смещение используются при анализе испытаний [39]. Более высокая нагрузка и большая площадь под кривой соответствуют лучшим характеристикам нажимного пальца. Sridharan et al. [22] сообщили о тестировании толкателем фольги Al6061-T6 на отожженных конструкциях из стали 4130 (Al6061-4130) и Al-Al (Al6061-6061). На рис. 11 показаны кривые «нагрузка-ход» при испытаниях нажимного пальца для стали Al6061-4130 и Al6061-6061.


Хорошо видно, что алюминиевая сталь показала среднюю максимальную нагрузку 2,85 кН и площадь под кривой 5,15 кН · мм. Al-Al в собранном виде показал среднюю максимальную силу 1,67 кН и площадь 1,53 кН · мм. Следовательно, алюминиевая сталь показала более высокую прочность, чем алюминий-алюминий. Это было связано с высокой пластической текучестью на границе раздела, приводящей к удалению оксида и разрушению шероховатости, улучшая металлургические связи и механические свойства. Кроме того, можно было бы ожидать такого поведения алюминиевой стали, поскольку сталь прочнее алюминия.

Wolcott et al. [39] сообщили о прочности отслаивания Al-Ti UAM, построенного с использованием метода нажимного штифта. Были использованы образцы в заводском состоянии и образцы, прошедшие термообработку (SPS), и их результаты показали, что термическая обработка увеличивает прочность на расслоение по сравнению с образцами в исходном состоянии (без обработки). Это также указывает на положительное влияние последующей обработки на механические свойства готовых соединений.

Несмотря на значительные усилия, приложенные для проведения испытаний на отслаивание, отрыв, выталкивание и толкание, эти методы все еще остаются спорными по ряду вопросов, включая их универсальную применимость и точность.Стандартизация этих методов испытаний необходима для того, чтобы иметь возможность сравнивать различные работы и полностью понимать применимость каждого теста и ограничения. Объединение данных, полученных в результате этих испытаний и исследований механических свойств в объеме, может предоставить более ценную информацию в отношении прочности сцепления.

5.6. Прочность на сдвиг

Прочность на сдвиг слоистых конструкций или конструкций является одним из наиболее важных изученных свойств. Для обеспечения точного тестирования в многослойной области / секции используются специальные инструменты [21].Строения UAM обычно испытывают ухудшение свойств, особенно в направлении строительства [13, 53]. Для улучшения качества сварных швов, особенно в направлении строительства, где применяется нормальная нагрузка, применялись последующие обработки, такие как SPS, HIP, а также растворение и старение, которые, как было показано, повышают прочность на сдвиг. Например, Wolcott et al. [39] сообщили о прочности на сдвиг соединений разнородных материалов Al-Ti, изготовленных с использованием UAM. Образцы в заводском состоянии и после обработки (SPS) были испытаны с использованием 50-кН Lloyd Mechanical Test Frame®, где нагрузка прикладывалась до разрушения.Их результаты [39] показали, что образец, обработанный SPS, имел более высокий предел прочности на сдвиг (102,4 МПа), чем образец в исходном состоянии (46,3 МПа). Поверхность излома показала, что в заводском исполнении возникло хрупкое разрушение, в то время как у SPS возникло вязкое разрушение, о чем свидетельствуют следы бороздок. Hopkins et al. [14] наблюдали аналогичное хрупкое разрушение UAM в оригинальном Al3003-Al3003, что объяснялось наличием пустот и недостаточным сцеплением. Леви и др. [21] изучали прочность на сдвиг готовых, обработанных SPS и HIP деталей из SAE4130 (низколегированная углеродистая сталь).На рис. 12 показаны типичные кривые нагрузки / смещения, полученные при испытаниях на сдвиг.


Из рисунка 12 видно, что образцы после дополнительной обработки SPS продемонстрировали прочность на сдвиг примерно в два раза выше, чем у образца после печати (максимальная нагрузка 4921 Н по сравнению с 1690 Н). Напечатанные образцы расслоились, и некоторые слои были изогнуты, как показано на рисунке 12. Из рисунка 12, SPS и HIP показали более высокое сопротивление сдвигу, чем состояние после печати. Сравнивая SPS и HIP, SPS имел более высокое сопротивление, чем HIP (максимальная нагрузка 4921 Н для SPS по сравнению с 3727 Н для HIP (Рисунок 12)).Это было связано с микроструктурой, в которой SPS показал только небольшие неоднородности по сравнению с исходными условиями и условиями HIP [21]. По этой причине SPS осталась нетронутой, несмотря на некоторые заметные деформации (рис. 12). Это также может быть связано с природой технологии SPS, которая известна для изготовления очень плотных материалов с небольшим количеством пустот или без них [54, 55, 59]. Необходимы дополнительные исследования, чтобы определить механизмы отказа и оптимальные условия постобработки.В последнее время большое внимание уделяется прочности на межфазный сдвиг композитного материала с металлической матрицей, изготовленного с помощью UAM [17, 60]. Например, Хер и Дапино [17] сообщили о поведении прочности на межфазный сдвиг матричных композитов NiTi-Al с различной обработкой поверхности волокна, включая оксидные, шероховатые, протравленные и механически полированные поверхности. Для всех тестируемых условий их результаты [17] показали, что матрица деформировалась до разрыва границы раздела из-за прилипшего алюминия. Среднее напряжение сдвига было близко или выше предельной прочности на сдвиг алюминиевых лент, используемых в процессе UAM.При всех состояниях поверхности матрица была самым слабым местом в композите. Из работы, представленной Хером и Дапино [17], информация, касающаяся изменения механизмов связи из-за различных условий поверхности, не обсуждалась. Следовательно, это требует дальнейшего изучения. Еще одна проблема, которую стоит изучить, – это изучение влияния остаточного напряжения сжатия на прочность на сдвиг конструкций UAM. В литературе этого найти не удалось.

5.7. Прочность на растяжение

Подобно испытаниям на сдвиг, испытания на растяжение также обеспечивают ценные механические свойства готовых деталей.В литературе свойства монотонного растяжения являются одними из наиболее часто оцениваемых и описываемых свойств деталей AM [50]. Для конструкций UAM растягивающая нагрузка обычно прикладывается перпендикулярно интерфейсам [13, 15], как показано на рисунке 13.


Направление нагрузки по отношению к направлению здания оказывает значительное влияние на наблюдаемые свойства. Sridharan et al. [15] сообщили об испытаниях на растяжение сборок UAM из лент Al6061-h28, испытанных в различных направлениях.Образцы собачьей кости при растяжении обрабатывались в трех направлениях: X – направление по ходу сонотрода, Y – направление вибрации сонотрода и Z – направление вдоль конструкции, где нагрузка прикладывается перпендикулярно к оси. интерфейсов, как показано на рисунке 14. На рисунке 14 также показаны типичные образцы для испытаний на растяжение, вырезанные из сборки.


Пять образцов были испытаны для каждого направления, и результаты сравнивались с объемным промышленным деформируемым сплавом.Направления X и Y считаются одинаковыми; следовательно, они взаимозаменяемы в [15]. На рисунке 15 показаны инженерные кривые напряжения-деформации для образцов. Из рисунка 15 видно, что UAM-деталь, нагруженная в направлениях X и Y , имела более низкие прочность и пластичность, чем деформируемый сплав. Кроме того, образцы, нагруженные по оси Z , показали значительное снижение уровня прочности по сравнению с образцами по направлениям X и Y и деформируемым сплавом.При тестировании в направлении Z (перпендикулярно интерфейсам) образцы не выдерживали из-за отсоединения лент без значительного удлинения [15]. Направление Z показало почти нулевую пластичность и привело к хрупкому разрушению, как показано на рисунке 15. Это связано с наличием дефектов или отсутствием полного соединения после UAM. Hopkins et al. [14] сообщили о прочности на поперечное растяжение UAM в готовом виде Al3003-h28 (лента) / Al3003-h24 (опорная плита). Образцы подвергались осевой нагрузке на 0.127 мм / с до разрушения, при этом регистрировались усилие и перемещение гидроцилиндра. Их графики [14] показали линейную зависимость силы от смещения, что указывает на то, что образцы разрушились в упруго-хрупком режиме. Кроме того, образцы с более высокой прочностью показали большие смещения, что означает, что было большее количество локализованных микромасштабных областей, которые подверглись пластическому разрушению [14]. Наблюдаемое в [14] хрупкое разрушение согласуется с выводами [13, 15]. Для хрупкого разрушения ожидается резкое падение кривой зависимости напряжения от деформации после достижения максимальной нагрузки.Авторы не предложили удовлетворительного объяснения такому поведению [15]. Возможно, такое поведение могло быть связано с различиями в качестве сцепления по слою. Подробная фрактография необходима, чтобы понять режимы отказа конструкции в разных направлениях.


Как упоминалось в разделе 3, дополнительная обработка UAM или UC в исходном состоянии используется для улучшения механических свойств связки, особенно в направлении Z (направление строительства) [13, 53].Гуссев и др. [13] изучали процессы растворения и старения с целью повышения прочности на разрыв связки Al6061-h28 UAM в исходном состоянии при различных температурах. Сначала образцы отжигали при 180 ° C в течение 8 часов, чтобы восстановить упрочняющий осадок Mg 2 Si, поскольку Al6061-h28 представляет собой дисперсионно-упрочненный сплав. Ожидается, что этот процесс улучшит свойства связки. Во-вторых, образцы были отожжены при 330 ° C в течение 1 часа для перекристаллизации зерен на границе раздела, и, наконец, образцы были растворены при 580 ° C в течение 1 часа, закалены в воде и выдержаны при 180 ° C в течение 8 часов. часНа рис. 16 показаны кривые инженерного напряжения и смещения для конструкции и эталона при различных условиях термообработки. Можно видеть, что свойства в направлении Z улучшались после каждого условия термообработки. Однако при 330 ° C-1 час наблюдалось снижение свойств в направлениях X и Y , включая эталон. Никакого конкретного объяснения этой тенденции не было дано, но это могло быть связано с взаимодействиями между растворенными атомами и дислокацией, которые зависят от температуры и скорости деформации [61].Для 180 ° C-8 ч средняя прочность на разрыв была увеличена вдвое. Это было связано с синергическим эффектом преципитации, уменьшения плотности дислокаций и умеренного укрупнения зерна [61]. Наконец, при обработке 580 ° C-1 час / 180 ° C-8 часов прочность на разрыв была значительно увеличена, и свойства в направлениях X – и Y были сопоставимы с эталонным образцом. Эта тенденция объясняется значительным измельчением зерна на границах раздела и, как следствие, улучшением свойств.Несмотря на усилия, предпринятые для постобработки сборок UAM, все еще необходимы дополнительные исследования для оптимизации параметров термообработки. Например, проблемы с истощением (рост зерна) могут отрицательно сказаться на механических свойствах конструкции. Следовательно, в этом отношении все еще необходимы дополнительные исследования.


5.8. Усталость

Усталостное поведение конструкций или деталей, изготовленных с помощью UAM, очень важно для определения потенциального или расчетного срока службы в условиях циклического нагружения.В то время как исследования усталостной долговечности деталей, изготовленных аддитивным способом, широко известны для других методов AM [62–70], до сих пор нет адекватных и существенных отчетов о характеристиках усталостной долговечности деталей UAM. Большинство отчетов UAM сосредоточено на оптимизации параметров обработки [14, 29, 34, 40, 44], микроструктуры [12, 22, 28, 41, 45, 46], сдвига межфазного соединения [17, 48] и прочности на разрыв [ 13–15], твердость [10, 12, 16, 20, 27]. Более того, такие испытания, как прочность на растяжение и сдвиг, могут обеспечить более адекватное указание / информацию о свойствах на границе раздела, чем испытания на усталость.Для конструкций UAM ожидается, что слоистая или слоистая структура будет иметь другие механизмы усталости и разрушения по сравнению с монолитным сплавом [35]. Однако было мало попыток исследовать усталостное поведение готовых из UAM алюминиевых сплавов Al2024 [35, 71] и Al3003-h28 [72]. He et al. В [35] изучалась усталость готового сплава Al2024 из фольги по сравнению с монолитным сплавом. Испытания на усталость при статической трехточечной нагрузке при изгибе проводились при двух уровнях напряжения: максимальные напряжения составляли 89% и 70% от прочности на разрыв для R = 0.1 ( R – коэффициент напряжений, используемый при испытаниях на усталость, который представляет собой минимальное пиковое напряжение, деленное на максимальное пиковое напряжение). Данные испытаний на усталость представлены в таблице 4. Из таблицы 4, L1-L3 и L4-L6 представляют результаты образцов Al-Al при низком и высоком уровнях напряжения, соответственно. S1-S3 представляют результаты при высоких уровнях напряжения для образца Al, которые выше (~ 30 МПа), чем уровни напряжения, используемые для L4-L6. Из таблицы видно, что усталостная долговечность Al-Al увеличивается с уменьшением приложенного напряжения.При высоком уровне напряжения (89%) образцы Al-Al и Al имели сопоставимую усталостную долговечность.

2

усталостная долговечность Средняя усталостная долговечность ( N f ) 904 4 9060 5,4 4
Образец σ n (МПа) n (%) n (%)
L1 289.04 70 4,72 × 10 4 4,72 × 10 4
L2 289,04 6,25 × 10 4
L4 367,50 89 1,87 × 10 4 1,66 × 10 4
L5 367,50 367.50 1,30 × 10 4
S1 399,84 89 1,39 × 10 4 1,57 × 10 4
S2 4
S3 399,84 1,78 × 10 4

σ

5 номинальное напряжение , приложенное максимальное опасное напряжение

-раздел; n представляет собой отношение максимального напряжения, приложенного при испытании на усталость, к пределу прочности при растяжении.

Wolcott и Dapino [72] сообщили об испытаниях на усталость при поперечном растяжении блока Al3003-h28. Их [72] кривая “напряжение-число циклов” (S-N) была относительно плоской, и существует пороговое значение напряжения в 50% от предельной прочности на разрыв в поперечном направлении, ниже которого разрушение не происходит в течение 3,75 × 10 7 циклов. Они [72] отметили, что представленные ими предварительные данные об утомляемости являются только прогнозом. Можно сказать, что UAM все еще находится на стадии разработки, и многое еще предстоит сделать для получения данных о усталостной долговечности для деталей UAM в исходном состоянии.Как правило, данные о усталостной долговечности деталей, изготовленных аддитивным способом, имеют значительный разброс из-за наличия дефектов [50]. Например, шероховатость поверхности является одним из факторов, ограничивающих усталостные характеристики деталей из AM [50]. При испытании усталостной долговечности деталей UAM необходимо учитывать несколько соображений и факторов. Необходимо учитывать влияние дефектов (пустот), направления строительства, остаточных напряжений, шероховатости поверхности, постобработки и, что наиболее важно, качества склеивания на усталостную долговечность.Оптимизация параметров процесса и анализ усталостных отказов имеют решающее значение для понимания и прогнозирования усталостной долговечности этих деталей.

Применение механической обработки поверхности – одна из наиболее важных дополнительных обработок, которые оказывают значительное влияние на усталостные свойства. Механическая обработка поверхности пластически деформирует поверхность и вызывает деформационное упрочнение. Возникают глубокие уровни остаточных напряжений сжатия при улучшении свойств поверхности и подповерхностных слоев. Индуцированные напряжения замедляют зарождение и распространение трещин, что приводит к улучшенным усталостным свойствам [51].Например, лазерное ударное упрочнение (LSP) [73], дробеструйное упрочнение (SP) [74], ультразвуковое ударное упрочнение (UIP) [75], ультразвуковая модификация нанокристаллической поверхности (UNSM) [76] и выглаживание с низкой пластичностью (LPB). [77] – все виды механической обработки поверхности, которые показали повышенные усталостные свойства компонентов. Для получения более подробной информации Гуджба и Медрадж [51] рассмотрели процесс лазерной упрочнения и его влияние на свойства материала по сравнению с SP и UIP. Стоит отметить, что вышеупомянутые механические обработки поверхности не только вызывают глубокие остаточные напряжения, но также имеют различные уровни деформационного упрочнения [78].Следовательно, выбор лечения должен быть сделан в соответствии с желаемыми свойствами и применением. До сих пор ни один из этих способов не был исследован в отношении улучшения свойств UAM-сборок. Устранение этого пробела в исследованиях имеет первостепенное значение и может дать ценные указания в изучении усталостной долговечности сборок UAM. Еще один фактор, который необходимо учитывать при испытании на усталостную долговечность, – это шероховатость / шероховатость поверхности конструкций UAM. Как упоминалось в разделе 5, чистота или шероховатость поверхности значительно влияют на свойства поверхности, что может ограничивать усталостные характеристики.Для улучшения усталостных характеристик гладкая поверхность должна быть получена либо во время изготовления, либо после изготовления. Интересно, что некоторые виды механической обработки поверхности, такие как UNSM и LPB, обеспечивают высококачественную отделку поверхности, которая может улучшить усталостные характеристики. Высококачественная поверхность в сочетании с индуцированными сжимающими остаточными напряжениями может обеспечить повышенные усталостные характеристики. Это исследование требует значительного внимания, и необходимо тщательно выбирать параметры процесса.

5.9. Ползучесть

Сообщалось о ползучести других готовых частей AM, как и в случае усталости [77, 79–83]. Однако литературных работ по пониманию ползучести деталей UAM найти не удалось. Микроструктурные дефекты являются одним из факторов, которые могут ограничивать ползучесть материалов. Другими факторами, ограничивающими ползучесть деталей UAM, являются сложность испытания на ползучесть при выборе температур испытания и приложенных напряжений [50]. Большинство сборок через UAM предназначены для низкотемпературных приложений.Например, большинство материалов, производимых UAM, представляют собой сплавы на основе алюминия, и это может быть причиной того, что ползучесть этих материалов не вызывает значительного интереса. Однако будет интересно создать такие материалы, как IN718 [79, 80, 83] и IN738LC [81, 82], и исследовать их поведение ползучести, поскольку они предназначены для высокотемпературных применений. В этом случае первостепенное значение имеет тщательный выбор параметров испытания на ползучесть, особенно для разнородных материалов.

6. Проблемы и перспективы на будущее

Несмотря на необходимость понимания механических свойств деталей AM в процессе их изготовления, все еще существует проблема прямого сравнения свойств материалов, изготовленных с помощью различных методов AM.Это связано со многими параметрами обработки, типом изготовленного материала, применением и наличием различных типов и количества дефектов, а также с ограничениями, связанными с различными методами AM. Например, UAM продемонстрировал большой потенциал в производстве металлических деталей и деталей из композиционных материалов с металлической матрицей, но этот процесс был ограничен из-за отсутствия широкого спектра применений, таких как высокотемпературные приложения. Были предприняты значительные усилия [12, 17, 22, 28, 45, 46, 48], чтобы понять характеристики интерфейса.Однако устранение межфазных дефектов по-прежнему является проблемой, с которой сталкиваются при создании UAM, даже несмотря на то, что последующая обработка показала многообещающие результаты. По-прежнему сложно сравнивать работы разных исследовательских групп. Во многом это связано с отсутствием стандартизированных и приемлемых процедур оценки механических свойств для сравнительных исследований [50]. По-прежнему требуется дополнительная работа для решения огромных проблем, связанных с пониманием механических свойств деталей AM. Для сравнительных исследований необходимы стандартизированные процедуры тестирования.

Несмотря на вышеупомянутые проблемы, которые необходимо решить, технология UAM успешно используется для различных промышленных приложений. Например, изготовление теплообменников со сложной внутренней геометрией с использованием металлов с высокой теплопроводностью было проблемой. Однако компания Fabrisonic® успешно создала теплообменники из меди и алюминия с использованием UAM. Этот продукт прошел строгие испытания НАСА, такие как термические, вибрационные и разрывные испытания [1]. Fabrisonic® также создала устройства управления температурой с размером канала от микромасштаба (250 мкм м) до макромасштаба (12.7 мм) для аэрокосмической техники. Также было достигнуто создание слоев из тантала, молибдена и титана с использованием UAM для защиты от излучения в конструкционных панелях. Здесь можно увидеть, что UAM имеет потенциал в различных отраслях, таких как электроника, аэрокосмическая промышленность и электроэнергетика. Это связано со способностью технологии создавать сложные геометрические формы с использованием похожих или разнородных материалов при относительно низких температурах изготовления.

7. Резюме

Процессам UAM или UC уделяется значительное внимание из-за преимуществ в создании 3D-построений с использованием схожих и разнородных материалов.Изготовление 3D-деталей достигается при относительно низкой температуре по сравнению с другими технологиями AM. Это позволяет встраивать хрупкие компоненты, такие как электроника, в твердые детали. Например, микропроцессоры, телеметрия и датчики были успешно внедрены с использованием UAM. Поскольку во время обработки достигается лишь умеренный уровень нагрева, строительный материал не претерпевает изменений фазы. Другими словами, исходные свойства материала сохраняются в свойствах конечного составляющего материала.Дефекты – это общие черты, наблюдаемые на межфазных связях, которые значительно влияют на свойства. Однако было показано, что постобработка, такая как обработка HIP и SPS, улучшает свойства связи. Хотя сообщалось о значительных работах по оптимизации процесса и микроструктуре межфазных связей, обширные работы в отношении механических свойств все еще ограничены. Во многом это связано с отсутствием стандартизированных процедур тестирования и ограниченным количеством приложений. Например, до сих пор отсутствуют испытания на усталость и свойства ползучести конструкций UAM.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *