ТК РФ Статья 282 – Статья 288

Статья 282. Общие положения о работе по совместительству

Совместительство – выполнение работником другой регулярной оплачиваемой работы на условиях трудового договора в свободное от основной работы время.

Заключение трудовых договоров о работе по совместительству допускается с неограниченным числом работодателей, если иное не предусмотрено федеральным законом.

Работа по совместительству может выполняться работником как по месту его основной работы, так и у других работодателей.

В трудовом договоре обязательно указание на то, что работа является совместительством.

Не допускается работа по совместительству лиц в возрасте до восемнадцати лет, на работах с вредными и (или) опасными условиями труда, если основная работа связана с такими же условиями, а также в других случаях, предусмотренных настоящим Кодексом и иными федеральными законами.

Особенности регулирования работы по совместительству для отдельных категорий работников (педагогических, медицинских и фармацевтических работников, работников культуры) помимо особенностей, установленных настоящим Кодексом и иными федеральными законами, могут устанавливаться в порядке, определяемом Правительством Российской Федерации, с учетом мнения Российской трехсторонней комиссии по регулированию социально-трудовых отношений.

Статья 283. Документы, предъявляемые при приеме на работу по совместительству

Лицо, поступающее на работу по совместительству к другому работодателю, не предъявляет трудовую книжку в случае, если по основному месту работы работодатель ведет трудовую книжку на данного работника или если в соответствии с настоящим Кодексом, иным федеральным законом трудовая книжка на работника не оформлялась. При приеме на работу по совместительству, требующую специальных знаний, работодатель имеет право потребовать от работника предъявления документа об образовании и (или) о квалификации либо его надлежаще заверенной копии, а при приеме на работу с вредными и (или) опасными условиями труда – справку о характере и условиях труда по основному месту работы.

Статья 284. Продолжительность рабочего времени при работе по совместительству

Продолжительность рабочего времени при работе по совместительству не должна превышать четырех часов в день. В дни, когда по основному месту работы работник свободен от исполнения трудовых обязанностей, он может работать по совместительству полный рабочий день (смену). В течение одного месяца (другого учетного периода) продолжительность рабочего времени при работе по совместительству не должна превышать половины месячной нормы рабочего времени (нормы рабочего времени за другой учетный период), установленной для соответствующей категории работников.

Ограничения продолжительности рабочего времени при работе по совместительству, установленные частью первой настоящей статьи, не применяются в случаях, когда по основному месту работы работник приостановил работу в соответствии с частью второй статьи 142 настоящего Кодекса или отстранен от работы в соответствии с частями второй или четвертой статьи 73 настоящего Кодекса.

Статья 285. Оплата труда лиц, работающих по совместительству

Оплата труда лиц, работающих по совместительству, производится пропорционально отработанному времени, в зависимости от выработки либо на других условиях, определенных трудовым договором.

При установлении лицам, работающим по совместительству с повременной оплатой труда, нормированных заданий оплата труда производится по конечным результатам за фактически выполненный объем работ.

Лицам, работающим по совместительству в районах, где установлены районные коэффициенты и надбавки к заработной плате, оплата труда производится с учетом этих коэффициентов и надбавок.

Статья 286. Отпуск при работе по совместительству

Лицам, работающим по совместительству, ежегодные оплачиваемые отпуска предоставляются одновременно с отпуском по основной работе. Если на работе по совместительству работник не отработал шести месяцев, то отпуск предоставляется авансом.

Если на работе по совместительству продолжительность ежегодного оплачиваемого отпуска работника меньше, чем продолжительность отпуска по основному месту работы, то работодатель по просьбе работника предоставляет ему отпуск без сохранения заработной платы соответствующей продолжительности.

Статья 287. Гарантии и компенсации лицам, работающим по совместительству

Гарантии и компенсации лицам, совмещающим работу с получением образования, а также лицам, работающим в районах Крайнего Севера и приравненных к ним местностях, предоставляются работникам только по основному месту работы.

Другие гарантии и компенсации, предусмотренные трудовым законодательством и иными нормативными правовыми актами, содержащими нормы трудового права, коллективными договорами, соглашениями, локальными нормативными актами, предоставляются лицам, работающим по совместительству, в полном объеме.

Статья 288. Дополнительные основания прекращения трудового договора с лицами, работающими по совместительству

Помимо оснований, предусмотренных настоящим Кодексом и иными федеральными законами, трудовой договор, заключенный на неопределенный срок с лицом, работающим по совместительству, может быть прекращен в случае приема на работу работника, для которого эта работа будет являться основной, о чем работодатель в письменной форме предупреждает указанное лицо не менее чем за две недели до прекращения трудового договора.

Как правильно уволить сотрудника?

Вопрос – ответ.

Когда можно уволить мать ребенка до трех лет?

Работодатель уволил сотрудницу-совместителя, вышедшую из отпуска по уходу за ребенком на том основании, что на ее место принят человек, для которого эта работа является основной. Уволенная сотрудница не согласилась с действиями работодателя. По ее мнению, он нарушил ч. 4 ст. 261 ТК РФ, которая запрещает увольнять по инициативе работодателя женщину, имеющую ребенка до трех лет, одинокую мать, воспитывающую ребенка-инвалида в возрасте до 18 лет или малолетнего ребенка (в возрасте до 14 лет). Действия работодателя сотрудница обжаловала в суде, но поддержки не нашла.

Как указали судьи в апелляционном определении, в данном случае увольнение произошло не по инициативе работодателя. Сотрудница была уволена в соответствии со ст. 288 ТК РФ, то есть в связи с выходом сотрудника, для которого эта работа была основной.

Отметим, что не все суды занимают такую позицию. Большинство из них встают на защиту женщин, имеющих детей до трех лет.

Когда замужнюю женщину с ребенком нельзя уволить по сокращению?

Увольнять одинокую женщину, воспитывающую ребенка до 14 лет, по сокращению штата или численности нельзя (ч. 4 ст. 261 ТК РФ).

Как указал суд, если женщина, имеющая статус одинокой матери, вышла замуж, но ее супруг ребенка не усыновил, то на эту работницу в полной мере распространяется правило о запрете увольнения.

Судьи установили, что работница со статусом одинокой матери имеет удостоверение одинокой матери и ежемесячные выплаты на ребенка до 2020 года.

Как следует из Обзора законодательства и судебной практики Верховного Суда Российской Федерации за первый квартал 2010 года, утвержденного постановлением Президиума Верховного Суда Российской Федерации от 16. 06.2010, ни в Трудовом кодексе Российской Федерации, ни в иных федеральных законах определения понятия одинокой матери, равно как и лица, воспитывающего ребенка без матери, не содержится.

Вместе с тем прежнее регулирование в области социальной защиты материнства и детства сделало понятие одинокой матери общепризнанным. Это женщина, не состоящая в браке, у которой в свидетельствах о рождении детей запись об отце отсутствует или эта запись произведена в установленном порядке по указанию матери (при сохранении права на получение установленных выплат в случае вступления одинокой матери в брак). При этом наравне с такими матерями соответствующие денежные выплаты назначались женщинам, не состоящим в браке, записанным в качестве матерей усыновленных ими детей, а в отдельные периоды – также вдовам и вдовцам, имеющим детей и не получающим на них пенсию по случаю потери кормильца или социальную пенсию.

На основании этого судьи сделали вывод, что мать обладает статусом одинокой, если является единственным лицом, наделенным родительскими правами и несущим родительские обязанности по воспитанию своих детей. Женщина сохраняет статус одинокой матери и при последующем вступлении в брак при условии сохранения выплат как одинокой матери.

Сотрудника, которого забыли предупредить об окончании срока трудового договора, нельзя уволить.

При расторжении трудового договора в связи с истечением срока его действия сотрудника необходимо уведомить об этом не позднее чем за 3 календарных дня.

Верховный Cуд рассмотрел дело по жалобе сотрудника на незаконное увольнение. Сотрудника не предупредили об окончании срока договора. Суд признал это нарушение существенным.

Апелляционным определением суд признал увольнение незаконным и восстановил сотрудника на работе.

Когда можно уволить сотрудника, который отозвал свое заявление на увольнение?

Работник подал заявление на увольнение по собственному желанию, однако до истечения срока двухнедельного предупреждения решил отозвать заявление.

Работодатель отказал в отзыве заявления, указав, что на должность работника уже приглашен другой кандидат, которому нельзя отказать в трудоустройстве. Новый работник приступил к исполнению обязанностей, а бывший работник, посчитав свои права нарушенными, пошел в суд.

Суд отметил следующее: действительно, ч. 4 ст. 80 ТК РФ допускает увольнение сотрудника, который решил отозвать заявление. Однако это можно сделать, только если в письменной форме на эту должность приглашен другой сотрудник, которому нельзя отказать в приеме.

В трудовом законодательстве упоминается единственный случай, когда сотруднику, приглашенному в письменной форме, нельзя отказать в трудоустройстве – если он увольняется от другого работодателя в порядке перевода (п. 5 ч. 1 ст. 77 ТК РФ).

Изучив трудовую книжку нового сотрудника, судьи обнаружили, что с прежнего места работы он уволен не в порядке перевода, а по соглашению сторон. По мнению суда, в этом случае у бывшего работодателя (ответчика) не было оснований для отказа в отзыве заявления об увольнении.

Можно ли уволить сотрудника, который ушел с работы из-за плохого самочувствия, но к врачу не обращался?

Суд рассмотрел спор между организацией и бывшим сотрудником, который в свою смену покинул рабочее место в связи с плохим самочувствием. Работодатель посчитал отсутствие прогулом, поскольку работник в этот день не обратился к врачу.

Однако суд доводы работодателя не принял, и вот почему. Покидая рабочее место, работник оставил вместо себя другого дежурного (сменщика). Ранее сотрудники уже менялись сменами, это не требовало согласования руководства. Кроме того, в ходе рассмотрения дела суд установил, что сотрудник наблюдался у терапевта и невролога до и после описанного случая. Свидетели подтвердили, что в указанный день их коллега плохо себя чувствовал.

Все это судьи признали уважительной причиной отсутствия сотрудника на работе, поэтому подтвердили незаконность его увольнения.

Когда можно уволить беременную женщину?

Увольнение беременной женщины по инициативе работодателя не допускается. Исключение – случаи ликвидации работодателя (ч. 1 ст. 261 ТК РФ). Если с беременной женщиной заключен срочный трудовой договор, работодатель обязан его продлить до конца беременности. Исключение составляют случаи, когда трудовой договор заключен на период отсутствия основного работника (ч. 2 и ч. 3 ст. 261 ТК РФ). Однако и в такой ситуации работодатель тоже не может просто так уволить беременную сотрудницу. Он должен предложить ей все имеющееся вакансии, которые она может занять с учетом квалификации и состояния своего здоровья.

Суд рассмотрел жалобу беременной женщины, уволенной с должности помощника начальника военного учета в военном комиссариате в связи с выходом на работу основной сотрудницы. По мнению заявительницы, ей не предложили имеющиеся вакантные должности.

При рассмотрении дела суд выяснил, что бывшая работница имела средне-специальное образование по специальности “Страховое дело”, воинское звание отсутствовало. Все имеющееся на момент выхода постоянной сотрудницы должности в военкомате в соответствии с установленными квалификационными требованиями обязывали соискателя иметь высшее образование и (или) офицерское звание, а работу сторожа беременная женщина не могла выполнять, поскольку труд беременных ночью запрещен. Все это позволило суду сделать вывод, что увольнение сотрудницы законно.

Подготовлено с использованием ресурса 1С:ИТС. 

Возможно, Вас так же заинтересует:

Комментарий к статье 288 ТК РФ. Дополнительные основания прекращения трудового договора с лицами, работающими по совместительству

Комментарий к статье 288

1. Федеральный закон от 30 июня 2006 г. N 90-ФЗ внес в комментируемую статью некоторые дополнения, призванные повысить гарантии при увольнении работников, работающих по совместительству.

Во-первых, в соответствии с новой редакцией комментируемой статьи предусмотренное в ней дополнительное основание для прекращения трудового договора может применяться не ко всем работникам, заключившим трудовой договор о работе по совместительству, а только к тем, кто заключил такой договор на неопределенный срок. Следовательно, работник, заключивший срочный трудовой договор о работе по совместительству, может быть уволен лишь на общих основаниях, предусмотренных ТК или иным федеральным законом (см. коммент. к ст. 77). Дополнительное основание, предусмотренное ст. 288, к нему не применяется.

Во-вторых, новая редакция ст. 288 предусматривает обязанность работодателя заранее, не менее чем за 2 недели, предупреждать работника о прекращении с ним трудового договора в связи с приемом на его место (должность) работника, для которого эта работа будет основной. Причем такое предупреждение должно быть сделано в письменной форме.

2. Комментируемая статья не предусматривает преимущественного права совместителей на заключение трудового договора о выполнении этой же работы как основной, если работодатель принял решение принять на эту работу другое лицо, для которого она будет основной.

В связи с этим работник, заключивший трудовой договор о работе по совместительству, не вправе требовать от работодателя принять его на это же место (должность) как на основную работу.

Вместе с тем по соглашению с работодателем работник может быть принят на работу, выполняемую им по совместительству, как на основную. Однако в этом случае трудовой договор о работе по совместительству должен быть прекращен и вместо него заключен другой трудовой договор на новых условиях.

Увольнение совместителя в связи с выходом на работу основного сотрудника является увольнением по инициативе работодателя

03.06.2021 Работодателю

Читайте в новостях 1С:ИТС. А также вас ждёт другая полезная информация: Нужно ли знакомить работников с графиком работы под подпись? Нужно ли включать в доходы при УСН компенсацию коммуналки от арендаторов?

Документ

Определение Судебной коллегии по гражданским делам Верховного Суда Российской Федерации от 15.03.2021 № 33-КГ20-7-К3

Комментарий

Для сотрудников, работающих по совместительству, в статье 288 ТК РФ установлено дополнительное основание расторжения трудового договора. Их можно уволить в связи с приёмом на работу основного сотрудника. В то же время в ТК РФ нет обязательного требования принимать на работу по основному месту своего внешнего совместителя, если он уволился с основного места у другого работодателя. Коллизия этих двух положений попала на рассмотрение в Верховный Суд РФ.

Внешний совместитель уволилась с основного места работы (по собственному желанию) и подала заявление работодателю по совместительству о приёме её на основное место работы. Работодатель это заявление не рассмотрел, но менее чем через неделю уведомил сотрудницу о расторжении трудового договора по совместительству в связи с приёмом на работу сотрудника, для которого работа будет основной. Своё увольнение сотрудница обжаловала в суде на том основании, что она является одинокой матерью, воспитывающей ребёнка до 14 лет, следовательно, на неё распространяется запрет на увольнение по инициативе работодателя (ч. 4 ст. 261 ТК РФ).

Нижестоящие суды признали увольнение законным. Однако верховные судьи это решение отменили.

Как указал Верховный Суд РФ, положениями главы 44 ТК РФ о работе по совместительству не предусмотрено преимущественного права совместителей на заключение трудового договора о выполнении этой же работы как основной. Такой работник может быть принят на работу, выполняемую им по совместительству, как на основную в порядке и на условиях, предусмотренных общими нормами ТК РФ.

Также судьи признали, что расторжение трудового договора по совместительству на основании статьи 288 ТК РФ является по своей сути увольнением по инициативе работодателя. Следовательно, к такому увольнению применяются все гарантии, установленные ТК РФ при увольнении по инициативе работодателя. Одна из таких гарантий – часть 4 статьи 261 ТК РФ, которая запрещает увольнение одиноких матерей, воспитывающих детей до 14 лет.

Кроме того, Верховный Суд посчитал существенным и тот факт, что работодатель не ответил сотруднице на заявление о приёме на работу по основному месту. В соответствии со ст. 64 ТК РФ необоснованный отказ в заключении трудового договора запрещён. При этом, отказывая в заключении договора, работодатель обязан сообщить причину такого отказа работнику (если он обратился с таким требованием письменно). Верховный Суд отметил, что вопрос о причинах, по которым работодатель не ответил на заявление совместителя, нижестоящие судьи также не исследовали.

Все это привело к возвращению дела на новое рассмотрение в апелляционный суд.

Источник: информационная система 1С:ИТС

Другие новости 1С:ИТС

• Нужно ли знакомить работников с графиком работы под подпись? Подробнее…
• Нужно ли включать в доходы при УСН компенсацию коммуналки от арендаторов? Подробнее…
• Как в казённом учреждении учесть субсидию из ФСС РФ за трудоустройство безработного гражданина? Подробнее…
• Какими проводками отразить безвозмездное поступление дипломов, грамот и их вручение? Подробнее. ..
• Как принять на работу удалённого сотрудника. Подробнее…
• Можно ли после перехода на общий режим принять к вычету НДС, предъявленный в период применения УСН? Подробнее…
• Можно ли учесть при УСН расходы на покупку ПО в период применения общей системы? Подробнее…
• Можно ли при УСН учесть расходы на обновление сайта? Подробнее…
• В каких случаях организации откажут в отсрочке или рассрочке по оплате налогов? Подробнее…
• Какова ответственность за непредставление формы СЗВ-ТД? Подробнее…
• Допустим ли вычет, если счёт-фактура получен от контрагента на УСН? Подробнее…
• Какой КПП указать крупнейшему налогоплательщику в декларации по налогу на имущество? Подробнее…
• Какими способами можно учитывать расходы на приобретение неамортизируемого имущества? Подробнее. ..
• Можно ли принять к вычету НДС при безвозмездном получении имущества? Подробнее…
• Как оформить счёт-фактуру, если бракованный товар возвращается не продавцу, а третьему лицу? Подробнее…
• Как в “1С:УНФ” проверить резерв под заказ и обеспечение заказа клиента? Подробнее…
• Как в “1С:УНФ” узнать, каким документом зарезервирован товар? Подробнее…
• Почему в “1С:УНФ” документ “Приходная накладная” формирует резерв? Подробнее…
• Как отразить в учёте возврат ошибочно уплаченной госпошлины? Подробнее…
• Увеличивают ли стоимость объекта строительства работы по инженерным изысканиям, проектированию? Подробнее…
• Как при расчёте НДС учитывать суммы, связанные с оплатой товаров (работ, услуг)? Подробнее…
• Можно ли вернуть из кассы денежные средства, которые физлицо перечислило ошибочно на расчетный счёт? Подробнее. ..
• Какой код отчётного периода указать в расчёте 6-НДФЛ при прекращении деятельности ИП? Подробнее…

Дополнительную информацию вы можете получить по телефону

+7 (3952) 78-00-00

Все новости ➔

Результаты трансплантации одного легкого при двустороннем легочном фиброзе

Пациенты

Двадцати пациентам с терминальной стадией легочного фиброза была проведена трансплантация одного легкого с ноября 1983 г. по август 1989 г. (таблица 1). У шестнадцати был идиопатический легочный фиброз. У остальных четырех был семейный легочный фиброз (один пациент), эозинофильная гранулема (один), саркоидоз (один) и легочный фиброз из-за химиотерапии (один).Пациенты были в возрасте от 15 до 61 года; 17 мужчин. В 16 лет пересадили левое легкое.

Критерии отбора

Были отобраны пациенты с прогрессирующим интерстициальным заболеванием легких в возрасте 60 лет или моложе (на момент включения). Эти пациенты демонстрировали неуклонное клиническое ухудшение с увеличением потребности в кислороде в покое, при физической нагрузке или в обоих случаях, несмотря на терапию кортикостероидами. По мнению лечащего врача, выживание более 12–18 месяцев маловероятно.Пациенты с другими системными заболеваниями или печеночной или почечной недостаточностью были исключены. Отобранные пациенты с раком в анамнезе имели безрецидивный период не менее пяти лет. Пациенты с клиническими признаками явной правожелудочковой недостаточности, не поддающиеся консервативной терапии, были исключены. Другие критерии отбора требовали, чтобы пациенты были способны к отлучению от кортикостероидов, имели адекватное питание (вес в пределах 10-15 процентов от идеального тела), были амбулаторными и мотивированными, не имели серьезных психиатрических проблем или проблем со злоупотреблением наркотиками и имели адекватную психосоциальную поддержку. .

Легочные функциональные пробы

Кривые максимального потока выдоха-объема регистрировали с использованием клиновидного спирометра и быстродействующего регистратора X—Y. Жизненная емкость легких (ЖЕЛ) и объем форсированного выдоха за одну секунду (ОФВ ₁ ) измерялись на той же записи с подключенным таймером. Диффузионную способность по монооксиду углерода (DLCO) определяли методом однократного вдоха. ³ Альвеолярный объем измеряли методом разбавления гелием на одном дыхании для каждого определения.Референтные значения для DLCO были основаны на измеренном альвеолярном объеме пациента. ³ Хотя многие лаборатории используют рост и возраст для прогнозирования DLCO, использование альвеолярного объема в уравнении прогноза является способом стандартизации легочных объемов. ⁴

Легочные функциональные тесты проводились, когда это считалось клинически необходимым у первых двух пациентов. В остальных случаях легочные функциональные тесты проводились каждые три месяца после трансплантации в течение первого года, каждые шесть месяцев в течение второго года и затем ежегодно.Ни один пациент не был потерян для последующего наблюдения.

Количественное перфузионное сканирование легких

После изменения перфузии трансплантированного легкого на нативное, больное легкое было продемонстрировано в связи с клиническим эпизодом отторжения у нашего первого пациента, ¹ , мы провели количественное последовательное перфузионное сканирование легких. у всех последующих пациентов. Первое сканирование легких обычно выполняли на третий день после трансплантации. Дальнейшие сканирования проводились каждую неделю в течение первого месяца, каждые три месяца в течение первого года и затем каждые шесть месяцев.

Пациентам в положении лежа внутривенно вводили 150 МБк ^99m Tc-меченого макроагрегированного альбумина. Один вид сзади был получен с помощью гамма-камеры с низкоэнергетическим универсальным коллиматором и компьютером. Шесть областей интереса были нанесены на карту над легкими, и были рассчитаны отношения количества в каждой области. Приток крови к каждому легкому рассчитывали и сообщали в процентах от общего кровотока.

Толерантность к физическим нагрузкам

Перед включением в программу трансплантации функциональное состояние пациентов оценивали с помощью теста шестиминутной ходьбы и модифицированного протокола упражнений Брюса на беговой дорожке. ⁵ Периодически их повторяли для оценки улучшения физической активности во время реабилитации перед операцией. После трансплантации пациенты повторно тестировались с трехмесячными интервалами в течение первого года, с шестимесячными интервалами в течение второго года и затем ежегодно.

В ходе теста с шестиминутной ходьбой пациентов просили пройти как можно быстрее и с комфортом по ровной 75-метровой дорожке в течение шести минут. При необходимости им давали отдохнуть.Регистрировали частоту отдыха, общее пройденное расстояние, частоту пульса и дыхания до и после теста. Модифицированный протокол Брюса выполнялся на беговой дорожке с различными уровнями и скоростями. Модификация заключалась в добавлении стадий 0 и 1/2, чтобы позволить оценить пациентов, неспособных к физической нагрузке на стадии 1. Стадия 0 была определена как ходьба со скоростью 2,7 км (1,7 мили) в час в горизонтальной плоскости, стадия 1/2 как ходьба с той же скоростью по 5-процентному уклону, 1-й этап как ходьба с этой скоростью по 10-процентному уклону, 2-й этап как ходьба на 4 км (2.5 миль) в час при 12-процентном уклоне, этап 3 — ходьба со скоростью 5,5 км (3,4 мили) в час при 14-процентном уклоне и этап 4 — ходьба со скоростью 6,8 км (4,2 мили) в час при 16-процентном уклоне, все за три минуты.

Статистический анализ

Данные представлены как среднее ±SD. Поскольку некоторые исходные данные были неполными, модель повторных измерений не могла быть подобрана без исключения пациентов с отсутствующими значениями. Поэтому линейные регрессии были подобраны для каждого пациента, чтобы получить индивидуальные оценки наклона каждой переменной за год.С использованием t-критерия средний наклон для пациентов сравнивали с нулем. Этот метод был повторен для VC, FEV ₁ , DLCO и значений перфузии.

В наборе данных был некоторый дисбаланс из-за отсутствия значений для некоторых пациентов. Была рассмотрена стратегия взвешивания для учета этого дисбаланса, но улучшение тестовой статистики было небольшим. ⁶ Поэтому приводятся результаты более простого t-критерия.

Шлем Shoei RF-1400 Dedicated 2

Шлем Shoei RF-1400 Dedicated 2

Великолепное качество, стильный и изящный дизайн, а также максимальный комфорт и безопасность сочетаются в компании, которая так же искренна в своей надежности, как и логотип, красующийся на ее лбу: Shoei с гордостью представляет свою последнюю итерацию культовой флагманской линейки RF, RF- 1400. Модель RF была основным продуктом в мотоциклетном сообществе с момента ее первого появления в 1984 году, а годы исследований и разработок привели к эволюции в области безопасности, дизайна, комфорта, шумоподавления и просто хорошего качества, которое может предоставить только Shoei.

Концепция дизайна

Испытания в аэродинамической трубе улучшили аэродинамику и вентиляцию RF, что помогло усовершенствовать конструкцию. Shoei удалось улучшить аэродинамику RF1200, уменьшив сопротивление на 4% и подъемную силу на 6%.Компактная аэродинамическая форма корпуса обеспечивает максимальную вентиляцию при обтекании вас воздухом, одновременно являясь самым легким полнолицевым шлемом, одобренным SNELL, в новых предложениях Shoei. Ни один гонщик не хочет отказываться от важных характеристик, которым подвергается большинство более легких шлемов, таких как шум ветра. Но RF-1400, будучи самым легким в линейке, не оставляет места для боли в ушах благодаря новой технологии шумоподавления.

Тишина

Форма спойлерной оболочки была разработана в аэродинамической трубе, и благодаря этому тестированию Shoei смогла обеспечить более тихую конструкцию оболочки, а также настроить форму полностью новой системы защиты CWR-F2, используя свою технологию Vortex Generator для вытеснения турбулентности ветра. .Абсолютно новая воздухонепроницаемая система окантовки обеспечивает ветрозащитную и водонепроницаемую изоляцию настолько плотно, что вы можете подумать, что настала ваша очередь открывать банку с маринованными огурцами. RF-1400 также оснащен более объемными подушечками для щек и съемными амбушюрами, которые помогают смягчить «дуновение» шума ветра.

Конструкция вкладыша Shell и EPS

Запатентованная технология объединяет матрицу из уложенных вручную переплетенных слоев стекловолокна и легких органических волокон, чтобы создать шлем, который не только соответствует рейтингам SNELL M2020 и DOT, но и является самой прочной и эластичной оболочкой Shoei, обеспечивающей владельцу оптимальное поглощение ударов. Кроме того, RF-1400 имеет двухслойную подкладку из пенополистирола различной плотности, которая также помогает поглощать удары и позволяет прохладному воздуху беспрепятственно проходить через каналы, созданные в подкладке. Точное размещение материала EPS помогло сформировать компактную и легкую конструкцию RF-1400.

Система защиты

Shoei отказалась от старых базовых пластин RF-1200 и полностью переработала конструкцию, чтобы представить вам систему базовых пластин CWR-F2. Основная цель системы состоит в том, чтобы облегчить более быструю и плавную смену щитов, что так же полезно, как и единственный «щелчок» от того, что наконец-то сняли крышку с этой банки с маринадом.Новый механизм регулировки щитка стал более плавным и точным, чем когда-либо, а переработанная шестерня опорной пластины представляет совершенно новую функцию открытия щитка в «первом положении» для улучшенной вентиляции и предотвращения запотевания. Однако Shoei не остановился на достигнутом! Все новое для серии RF — это удобно расположенный запирающий механизм, который равномерно распределяет усилия щита по обеим сторонам.

3D-щиток CWR-F2, изготовленный методом литья под давлением, обеспечивает поле зрения без искажений, защищая ваши глаза от 99% вредных ультрафиолетовых лучей солнца, а 2D-“внешняя” поверхность в сочетании с 3D-технологией обеспечивает агрессивный вид без ущерба для видимости.Соедините его с включенным на 10% более широким Pinlock EVO, чтобы устранить запотевание, а также отбросить любые проблемы с боковой видимостью.

Интерьер

RF-1400 оснащен полностью съемным, моющимся, заменяемым и регулируемым внутренним пространством, изготовленным из материалов Max-Dry, которые впитывают и рассеивают пот в два раза быстрее, чем традиционный нейлон. Мягкая и прочная ткань накладки для щек обеспечивает комфорт и мягкую посадку, а объемный многослойный материал накладки обеспечивает улучшенную стабилизацию и снижает уровень шума в шлеме.Настройте свою посадку с помощью дополнительных внутренних компонентов, предлагаемых в разных размерах.

Производительность вентиляции

Простите нас за то, что мы немного затянуты, но мы хотим, чтобы вы знали, насколько хорош этот шлем. Давайте еще немного направим этот ветер. Система вентиляции имеет 3 канала для управления 6 входами воздуха для вашего комфорта: 2 в центре, 2 в области подбородка и по 1 с каждой стороны от висков. Перемещенное вентиляционное отверстие в центре/лбу предлагает дополнительное вентиляционное отверстие по сравнению с его предшественником, а боковые вентиляционные отверстия также больше для большего забора воздуха.Большой, удобный 3-позиционный нижний вентиляционный клапан легко использовать в перчатках во время езды, а RF-1400 имеет переработанный увеличенный выпускной вентиляционный клапан с 4 выходными отверстиями, чтобы выталкивать горячий воздух, одновременно впуская весь этот приятный прохладный воздух.

Резюме

Shoei снова нашла правильный рецепт, чтобы вывести на рынок эффектный шлем по справедливой цене. RF-1400 предлагает больше, чем то, что большинство гонщиков ищут в шлеме, и это последнее предложение флагмана представляет собой прекрасный плавильный котел вневременного дизайна, аэродинамических характеристик, вентиляции, бесшумности, простоты использования, комфорта и высочайшего качества. сборка, материалы и производство, которые может предоставить только Shoei.

Особенности:

• Самый легкий Shoei в линейке
• 4 размера корпуса
• Расширенное шумоподавление
• Подкладка EPS двойной плотности
• Улучшенная вентиляция
• Подкладка 3D Max-Dry System II
• Э.К.Р.С. (аварийная быстросъемная система)
• Система защиты CWR-F2
• Аккуратно закрепленный подбородочный ремень
• Включает штифты Pinlock EVO и вставку для линз
.
• Включает защиту дыхания и шторку для подбородка
.
• Сертификация Snell M2020 и DOT

Примечание: Из-за ограничений производителя продукция Shoei может быть отправлена ​​только по адресам в США.

Влияние выбора эталонного гена для нормализации целевого гена на результаты эксперимента с использованием qRT-PCR в реальном времени в адипоцитах

Аннотация

Фон

В связи с нынешним ростом заболеваемости, связанной с ожирением, количественная полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией в режиме реального времени (qRT-PCR) стала широко используемым методом для оценки генов, экспрессируемых и регулируемых адипоцитами. Чтобы измерить точные изменения в относительной экспрессии генов и контролировать изменчивость между образцами, при определениях qRT-PCR обычно используется нормализация по эндогенным контрольным генам, относительная экспрессия которых не меняется.Однако исторические данные ясно продемонстрировали, что профили экспрессии традиционных контрольных генов (например, β-актина, GAPDH, α-тубулина) по-разному регулируются в различных типах тканей и экспериментальных условиях.

Методология/основные выводы

Таким образом, мы проверили шесть обычно используемых эндогенных контрольных генов в различных экспериментальных условиях воспалительного стресса, окислительного стресса, синхронного прогрессирования клеточного цикла и клеточной дифференцировки в адипоцитах 3T3-L1 с использованием TaqMan qRT-PCR.При каждом условии исследования мы дополнительно оценили влияние выбора эталонного гена на результаты эксперимента, используя примеры генов-мишеней, имеющих отношение к функции и дифференцировке адипоцитов. Мы демонстрируем, что несколько эталонных генов регулируются в зависимости от состояния, что не подходит для использования в нормализации целевого гена.

Заключение/значение

Представлены данные, демонстрирующие, что неправильный выбор референсного гена может оказать сильное влияние на выводы исследования, начиная от расходящихся статистических результатов и заканчивая неточной интерпретацией данных значительной величины.Это исследование подтвердило использование эндогенных контролей в адипоцитах 3T3-L1 и подчеркивает влияние неправильного выбора эталонного гена на интерпретацию данных и выводы исследования.

Образец цитирования: Фергюсон Б.С., Нам Х., Хопкинс Р.Г., Моррисон Р.Ф. (2010) Влияние выбора эталонного гена для нормализации целевого гена на экспериментальный результат с использованием qRT-PCR в реальном времени в адипоцитах. ПЛОС ОДИН 5(12): е15208. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0015208

Редактор: Дэвид С. Milstone, Brigham and Women’s Hospital, Соединенные Штаты Америки

Получено: 19 августа 2010 г.; Принято: 30 октября 2010 г.; Опубликовано: 13 декабря 2010 г.

Авторские права: © 2010 Ferguson et al. Это статья с открытым доступом, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Финансирование: Эта работа полностью или частично поддержана грантами Национального института здравоохранения NIDDK R15-DK082799 (RFM) и F31-DK847702 (BSF). Спонсоры не участвовали в разработке исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

Введение

Эпидемия ожирения привела к многочисленным исследованиям механизмов, регулирующих дифференцировку и функцию адипоцитов, а также роли жировой ткани в развитии резистентности к инсулину, диабета и сердечных заболеваний. По мере того, как наше понимание адипоцитов продвинулось от понимания депо к эндокринной клетке, возрастает потребность в изучении относительной экспрессии малочисленных генов (например, цитокинов, адипокинов), участвующих в регуляции метаболизма в ткани, которая традиционно дает ограниченное количество генов. РНК [1]–[4]. В то время как более ранняя работа с традиционной методологией обеспечивала качественную оценку количества мРНК, количественный характер qRT-PCR в реальном времени обеспечивает меру чувствительности, которая подходит для надежного обнаружения двукратных изменений в экспрессии генов в динамических диапазонах исходного материала [2]. , [5].Однако за эту методологию приходится платить, поскольку повышенная чувствительность количественной ОТ-ПЦР наряду с присущей ей изменчивостью биологических систем, несоответствием протоколов эксперимента и экстракции, а также различиями в эффективности обратной транскрипции и ПЦР делают нормализацию данных в реальном времени абсолютным требованием. для точной интерпретации данных об интересующих генах [5]–[8].

Было предложено несколько стратегий для нормализации данных qRT-PCR, наиболее распространенная из которых включает анализ коэкспрессированного эндогенного контроля (т.э., эталонный ген), относительная экспрессия которого не должна изменяться при лечении или условиях исследования [5], [7], [9]. Когда эти критерии строго соблюдаются, ожидается, что эта стратегия «нормализует» смешанные вариации из-за межвыборочной изменчивости, такой как различия в эффективности ПЦР или несоответствие нагрузки. β-актин, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа (GAPDH) и α-тубулин традиционно использовались в качестве контрольных, «домашних» генов для Нозерн-блоттинга и других традиционных, менее чувствительных анализов, несмотря на десятилетия отчетов, четко демонстрирующих профили экспрессии. которые заметно различаются в зависимости от клеточного фенотипа и дизайна эксперимента [10]–[12].В то время как в некоторых отчетах утверждается, что общие выводы исследования останутся теми же, поскольку вариабельность эталонного гена будет одинаковой между исследуемой и контрольной группами [13], в других отмечается, что нормализация на неподходящий эндогенный контроль может привести к неправильной интерпретации и смешению данных с qRT. ПЦР [7], [14], [15]. В то время как в многочисленных отчетах оценивались изменения в экспрессии эталонного гена в различных экспериментальных условиях [2], [4], [15], лишь немногие исследовали влияние отбора эталонного гена на интерпретацию данных и выводы исследования [14].

Чтобы оценить влияние выбора эталонного гена на результаты эксперимента, мы проверили шесть часто используемых эталонных генов, включая GAPDH, β-актин, рецептор трансферрина (TfR), циклофилин A (cyc), α-тубулин (α-tub) и 18 рибосомных генов. РНК (18S) с использованием химии и методологии TaqMan qRT-PCR в хорошо зарекомендовавшей себя клеточной линии адипоцитов 3T3-L1 в четырех различных условиях исследования, включая воспалительный стресс, окислительный стресс, синхронное развитие клеточного цикла и клеточную дифференцировку.При каждом условии исследования представлены данные, демонстрирующие влияние выбора эталонного гена на нормализованную экспрессию целевого гена. Этот отчет ясно демонстрирует критическую важность проверки эталонного гена для всех экспериментальных условий в отношении значимости, интерпретации и экспериментальных результатов при использовании чувствительности и надежности qRT-PCR для оценки относительной экспрессии генов.

Результаты

Влияние небольшой вариации экспрессии эталонного гена на статистическую значимость

Широко используемый метод коррекции межвыборочной изменчивости с помощью qRT-PCR включает нормализацию по одному или нескольким эталонным генам, экспрессия которых не должна изменяться при лечении или между условиями исследования [5], [7], [9].Таким образом, важно отличать техническую изменчивость от истинных биологических изменений в экспрессии генов. Для этой цели мы решили использовать руководящие принципы, ранее описанные Gorzelniak et al. [2], в соответствии с которыми эталонные гены классифицируются на основе обработанных и необработанных различий в количестве циклов, когда амплифицированный зонд пересекает порог (ΔC _T ) во время qRT-PCR. реакции. В соответствии с этими рекомендациями значения ΔC _T ≤ +/-0,5 считаются флуктуациями в экспрессии генов, которые в значительной степени обусловлены техническими различиями (например,г. , неравная загрузка, эффективность ПЦР и т. д.), которые должны одинаково отражаться как между эталонными, так и целевыми генами. И наоборот, значения ΔC _T ≥ +/-1,0 убедительно свидетельствуют о биологической изменчивости, возникающей в результате лечения или условий исследования, что исключает использование таких эталонных генов для нормализации генов-мишеней. Чтобы получить представление о значениях ΔC _T , которые находятся в диапазоне от 0,5 до 1,0, мы расширили рекомендации, наблюдая за экспрессией эталонного гена с течением времени после обработки для последовательных сдвигов направления между смежными точками данных, которые могли бы свидетельствовать о биологической дисперсии.

Используя критерий ΔC _T ≤ +/-0,5 в качестве ограничителя пригодности эталонного гена, мы оценили шесть обычно используемых эталонных генов (таблица 1) с течением времени в недифференцированных преадипоцитах 3T3-L1 после воздействия либо 1 нМ TNFα, либо 300 мкМ H ₂ O ₂ , представляющие состояния воспалительного и окислительного стресса соответственно. Поскольку значения ΔC _T являются экспонентами и не подлежат статистической оценке [16], все проверочные данные были преобразованы в «кратные изменения» с использованием метода 2 ^−ΔC _T для необработанных данных или 2 ^−ΔΔC _{. Метод T} для нормализованных данных.Соответственно, ΔC _T +0,5 и -0,5 эквивалентны 0,7- и 1,4-кратным изменениям относительной экспрессии генов соответственно. Как показано на рис. 1А, относительная экспрессия большинства (5 из 6) протестированных эталонных генов (α-tub, cyc, TfR, GAPDH и 18S) колебалась в пределах ΔC _T ≤ +/−0,5 таким образом, что соответствовать межвыборочной изменчивости и, таким образом, считаться пригодным для использования в нормализации гена-мишени после воздействия TNFα. Напротив, β-актин неуклонно и последовательно падал ниже ΔC _T ≤ +/-0.5 во все моменты времени после 3 часов после стимуляции TNFα (фиг. 1B). Поскольку ΔC _T для β-актина близко приближалась к значению 1,0 (т. е. уменьшению в 0,5 раза) в смежных временных точках, эти изменения, вероятно, были вызваны биологической изменчивостью, таким образом исключая этот обычно используемый референтный ген для пригодности в этих экспериментальных условиях. условия.

Рис. 1. Увеличение статистической значимости при неправильном выборе эталонного гена.

Тотальную РНК выделяли с течением времени из преадипоцитов 3T3-L1 с задержанной плотностью, обработанных 1 нМ TNFα, и оценивали экспрессию эталонного и целевого генов с помощью qRT-PCR.Сложите изменения в эталонных генах, которые попали в пределы (A) и за пределы (B) пределов пригодности ΔC _T ≤ +/−0,5. Сложите изменения в экспрессии гена Dusp10 без (C) и с нормализацией (D) до 18S, среднее геометрическое трех эталонных генов или β-актина. Звездочки указывают на значительные различия между обработанными и необработанными образцами (p<0,05).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0015208.g001

Чтобы оценить влияние использования β-актина в качестве эталонного гена, мы исследовали относительную экспрессию фосфатазы-10 с двойной специфичностью (Dusp10) без нормализации и с ней. либо 18S, среднее геометрическое трех стабильных эталонных генов (α-tub, TfR, GAPDH), либо β-актина после воздействия TNFα.Dusp10 был выбран для этого эксперимента как ген, не реагирующий на стимуляцию TNFα в данных условиях. Как показано на рис. 1D, кратность изменения экспрессии гена Dusp10 при нормализации к 18S или среднее геометрическое трех эталонных генов близко аппроксимировала кратность изменений, как показано для необработанного Dusp10 без нормализации (рис. 1C), где точки данных после лечения не были значительно отличается от необработанного контроля. Напротив, когда Dusp10 был нормализован к β-актину, каждая точка, в которой β-актин, находилась за пределами ΔC _T ≤ +/-0.5 диапазон разделителей значительно отличался от необработанных контролей. Таким образом, нормализация Dusp10 по β-актину привела к неточному «приросту» значимости, которого не было с 18S или средним геометрическим стабильных эталонных генов.

Аналогичные последствия в отношении неправильного выбора эталонного гена наблюдались в условиях окислительного стресса. Как показано на рис. 2B, β-актин и TfR были единственными двумя эталонными генами, которые стабильно увеличивались выше диапазона ΔC _T ≤ +/-0,5 более чем в одну непрерывную временную точку.Чтобы оценить влияние выбора эталонного гена, мы исследовали относительные изменения в экспрессии гена Dusp3 без нормализации и с нормализацией либо к 18S, либо к среднему геометрическому трех эталонных генов (GAPDH, cyc, α-tub), либо к β-актину после H ₂ . O ₂ воздействие. Dusp3 был выбран для этого эксперимента как ген, демонстрирующий умеренное (∼3-кратное), но значительное увеличение в ответ на стимуляцию H ₂ O ₂ . Когда Dusp3 нормализовали до 18S или среднего геометрического стабильных эталонных генов (рис.2D), кратность изменений близко соответствовала показателям, показанным для необработанного Dusp3 без нормализации (рис. 2C), где экспрессия гена значительно отличалась от необработанного контроля в каждой точке после 3 часов после воздействия H ₂ O ₂ . Однако, когда Dusp3 нормализовали по β-актину, ген-мишень больше не отличался значительно от необработанных контролей в любой точке, где этот эталонный ген выпадал за пределы диапазона пригодности ΔC _T ≤ +/-0,5. Таким образом, нормализация Dusp3 к β-актину в условиях окислительного стресса привела к неточной «потере» значимости, которая не происходила с 18S или средним геометрическим стабильных эталонных генов.В совокупности эти данные демонстрируют, что статистическая значимость сильно зависит от соответствующего выбора эталонного гена, даже когда изменения в экспрессии эталонного гена незначительны.

Рисунок 2. Потеря статистической значимости из-за неправильного выбора эталонного гена.

Тотальную РНК выделяли с течением времени из преадипоцитов 3T3-L1 с задержанной плотностью, обработанных 300 мкМ H ₂ O ₂ , и оценивали экспрессию эталонного и целевого генов с помощью qRT-PCR. Сложите изменения в контрольных генах, которые попали в пределы (A) и за пределы (B) ΔC _T ≤ +/−0. 5 пределов пригодности. Сложите изменения в экспрессии гена Dusp3 без (C) и с нормализацией (D) до 18S, среднего геометрического трех эталонных генов или β-актина. Звездочки указывают на значительные различия между обработанными и необработанными образцами (p<0,05).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0015208.g002

Влияние больших вариаций в экспрессии эталонного гена на результат эксперимента

Чтобы изучить влияние значительной изменчивости эталонного гена на экспрессию гена-мишени, мы проверили одни и те же шесть эталонных генов в различных экспериментальных условиях пролиферации и дифференцировки, оба из которых, как известно на протяжении десятилетий, заметно изменяют экспрессию обычно используемых эталонных генов. 11], [12].Ранние стадии дифференцировки адипоцитов 3T3-L1 характеризуются синхронным прогрессированием клеточного цикла [17], [18], где покоящиеся преадипоциты проходят один полный цикл клеточного деления в течение 24 часов после MDI одновременно с началом ранних стадий гена адипоцитов. выражение [19], [20]. Как показано на рис. 3A, 18S был единственным эталонным контролем, который не колебался за пределами приемлемого диапазона ΔC _T ≤ +/-0,5 в любой момент времени в течение первых 24 часов дифференцировки адипоцитов.Напротив, большинство (4 из 6) эталонных генов были дисквалифицированы в качестве соответствующих эталонных контролей на основании кратных изменений, которые превышали этот диапазон более чем в один непрерывный момент времени, при этом GAPDH и TfR демонстрировали заметное увеличение (> 4-кратное), явно указывающее на биологическая изменчивость. Экспрессия циклофилина А выходила за пределы ограничительного диапазона только через 24 часа с 2-кратным увеличением экспрессии гена (фиг. 3В).

Рисунок 3. Неточный результат эксперимента с неправильным выбором эталонного гена.

Тотальную РНК выделяли с течением времени (0–24 часа) из преадипоцитов 3T3-L1 с задержанной плотностью, обработанных MDI, и оценивали экспрессию эталонного и целевого генов с помощью qRT-PCR на ранних стадиях дифференцировки. Сложите изменения в эталонных генах, которые попали в пределы (A) и за пределы (B) пределов пригодности ΔC _T ≤ +/−0,5. Сложите изменения в экспрессии гена C/EBPβ без (C) и с нормализацией (D) до 18S, cyc или TfR. Сложите изменения в экспрессии гена циклина А без (E) и с нормализацией (F) до 18S, cyc или TfR.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0015208.g003

Чтобы оценить влияние выбора эталонного гена в этих условиях, мы оценили два неродственных целевых гена с хорошо установленными ролями на этой ранней стадии дифференцировки адипоцитов. Во-первых, мы исследовали профиль экспрессии транскрипционного фактора C/EBPβ, который известен своей ролью в инициировании каскада транскрипционных событий, завершающихся приобретением фенотипа зрелых адипоцитов [21]–[25].Нормализация C/EBPβ до 18S приводила к кратным изменениям в экспрессии генов (рис. 3D), которые были почти идентичны кратным изменениям исходной экспрессии без нормализации (рис. 3C), где 2 часа после MDI приводили к 9-кратной индукции целевого гена. экспрессия, которая снизилась до 4-кратной индукции к 6 часам, где она оставалась постоянно и стабильно повышенной в течение 24 часов. Эти результаты были очень похожи на хорошо задокументированный профиль экспрессии C/EBPβ с использованием традиционной методологии и согласовывались с его ролью в регуляции экспрессии C/EBPα и PPARγ, двух основных регуляторов адипогенеза, которые индуцируются примерно через 48 часов после начала дифференцировки [25]. ], [26].Напротив, однако, длительное увеличение экспрессии гена после 6 часов после MDI не было очевидным, когда C/EBPβ был нормализован по TfR, где 6-кратная индукция эталонного гена устраняла 4-кратную индукцию целевого гена. Поскольку наш скрининг не выявил три стабильных эталонных гена, которые можно было бы сгруппировать в среднем геометрическом, мы дополнительно нормализовали C/EBPβ к циклофилину А, который выходил за пределы диапазона пригодности ΔC _T ≤ +/−0,5 только через 24 часа. точка. Как показано на рис.3D, C/EBPβ, нормализованный по циклофилину А, приводил к кратным изменениям, которые близко приближались как к необработанному C/EBPβ, так и к изменениям, нормализованным к 18S, во все моменты времени, когда этот эталонный ген попадал в пределы ΔC _T ≤ +/-0,5. Однако двукратное увеличение циклофилина через 24 часа после MDI привело к 50% снижению экспрессии целевого гена в этот момент времени.

Затем мы оценили профиль экспрессии циклина А, который хорошо известен своей регулирующей ролью во время S-фазы пролиферации [27], [28], где было показано повышение уровня мРНК между 16 и 30 часами после MDI [26]. ].Точно так же профиль экспрессии был почти идентичен при сравнении экспрессии необработанного циклина А (рис. 3E) с профилем, нормализованным до 18S (рис. 3F), где экспрессия сначала снижалась ниже исходного уровня, а затем увеличивалась до 3-кратной индукции через 24 часа. . Когда тот же ген-мишень был нормализован до TfR, более чем 4-кратное увеличение TfR через 6 часов после MDI привело к резкому падению экспрессии циклина А, которое никогда не превышало исходный уровень без лечения на протяжении всего развития клеточного цикла (рис. .3F). Мы также нормализовали циклин А до циклофилина А, как обсуждалось выше, где профиль экспрессии приближался к наблюдаемому для необработанного циклина А, а также для циклина А, нормализованного до 18S, во все моменты времени, когда циклофилин колебался в диапазоне ΔC _T ≤ +/-0,5. пригодности. Однако в тот момент времени, когда циклофилин превышал этот диапазон, 3-кратное увеличение циклина А было ошибочно исключено из-за 2-кратного увеличения экспрессии циклофилина.

Далее мы оценили выбор эталонного гена в течение всего периода дифференцировки (0–10 дней после MDI), где 18S снова был единственным исследованным эталонным контролем, который явно колебался в пределах нашего ΔC _T ≤ +/−0.5 диапазон пригодности (рис. 4А). В этих условиях большинство (4 из 6) проверенных эталонных генов были дисквалифицированы как подходящие эталонные гены, поскольку экспрессия превышала диапазон ограничителя более чем в один непрерывный момент времени, при этом TfR и GAPDH демонстрировали заметное увеличение, а заметное снижение относительной экспрессии α-тубулина явно указывало на биологической изменчивости. Циклофилин А колебался за пределами диапазона ΔC _T ≤ +/-0,5 только через 24 часа после MDI. Чтобы проиллюстрировать влияние выбора эталонного гена в этих условиях, мы исследовали профиль экспрессии одного гена-мишени, индивидуально нормализованный по пяти различным эталонным генам с разной степенью пригодности. Для этого исследования мы выбрали транскрипционный фактор PPARγ, функция которого хорошо известна как доминирующий транскрипционный регулятор адипогенеза [29]–[31]. Как и ожидалось, профили экспрессии были почти идентичными по кинетике и величине при сравнении экспрессии необработанного PPARγ (рис. 4C) с экспрессией, нормализованной до 18S (рис. 4D), где экспрессия постепенно увеличивалась со 2 дня после MDI, достигая плато. через 8 дней после MDI с 40-кратной индукцией экспрессии генов. Поскольку циклофилин А выпал за пределы ΔC _T ≤ +/-0.5 только в один момент времени до индукции PPARγ, мы отметили небольшое отклонение в величине или кинетике при сравнении PPARγ, нормализованного по циклофилину А, по сравнению с 18S. Напротив, величина экспрессии PPARγ была резко ослаблена при нормализации к TfR по сравнению с 18S, достигая только 10-кратного увеличения экспрессии гена (рис. 4D). И наоборот, величина экспрессии PPARγ была резко увеличена при нормализации к α-тубулину, достигая почти 350-кратного увеличения экспрессии генов через 6 дней после MDI (рис. 4Е). Хотя величина конечной точки была почти одинаковой, нормализация PPARγ к GAPDH приводила к резкой задержке кинетики накопления мРНК PPARγ по сравнению с 18S (рис. 4F). В совокупности эти данные демонстрируют, что выбор эталонного гена может оказать глубокое влияние на результаты эксперимента, что свидетельствует о критической необходимости проверки каждого эталонного гена в зависимости от типа клеток и состояния.

Рис. 4. Направленные сдвиги результатов эксперимента при неправильном выборе эталонного гена.

Суммарную РНК выделяли с течением времени (0–10 дней) из преадипоцитов 3T3-L1 с задержанной плотностью, обработанных MDI, и оценивали экспрессию эталонного и целевого генов с помощью qRT-PCR во время полной дифференцировки адипоцитов. Сложите изменения в эталонных генах, которые попали в пределы (A) и за пределы (B) пределов пригодности ΔC _T ≤ +/−0,5. Сложите изменения в экспрессии гена PPARγ без (C) и с нормализацией до 18S, cyc или TfR (D), 18S, cyc или α-тубулина (E) и 18S, cyc или GAPDH (F). Стрелки указывают на сдвиги по направлению относительно нормализации до 18S.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0015208.g004

Обсуждение

В нашем отчете представлены эмпирические данные, демонстрирующие, что неправильный выбор референсного гена для нормализации qRT-PCR может оказать сильное влияние на выводы исследования, начиная от расходящихся статистических результатов и заканчивая неточной интерпретацией данных значительной величины. Во-первых, мы демонстрируем, что многие обычно используемые эталонные гены колеблются в зависимости от состояния, выходящих за пределы пригодности, при нормализации экспрессии целевого гена с использованием qRT-PCR.Во-вторых, мы показываем, что даже небольшая вариабельность в экспрессии эталонного гена может иметь заметное влияние на наличие или отсутствие статистической значимости между группами исследования, особенно когда гены-мишени демонстрируют умеренные изменения в количестве мРНК. В-третьих, в этом отчете показано, что неправильный выбор подходящего эталонного гена может привести к получению крайне неточных данных, которые существенно повлияют на интерпретацию биологических результатов и выводов исследования. Эти данные в совокупности демонстрируют, что проверка каждого эталонного гена на индивидуальной основе для всех условий лечения и эксперимента имеет первостепенное значение для точной интерпретации данных при нормализации межвыборочной изменчивости с использованием qRT-PCR.

Данные, представленные здесь и в другом месте [14], ясно демонстрируют, что наличие или отсутствие статистически значимых различий между исследуемыми группами может зависеть от того, какой эталонный ген используется для нормализации, даже когда вариабельность экспрессии эталонного гена незначительна. Сравнивая результат нормализации по β-актину по сравнению с 18S, мы представляем данные по двум генам; Dusp10, исходный профиль которого не менялся со временем после TNFα (рис. 1), и Dusp3, который увеличивался после H ₂ O ₂ со статистической значимостью.Ни на профиль экспрессии, ни на значимость в генной экспрессии любого гена не оказало заметного влияния нормализация до 18S или среднего геометрического трех стабильных эталонных генов. Напротив, нормализация Dusp10 и Dusp3 к β-актину привела к неточному увеличению или потере значимости соответственно, демонстрируя, что даже небольшая, менее чем двукратная вариация в экспрессии эталонного гена может иметь значительное влияние на статистический результат. Оба эксперимента представили доказательства биологической изменчивости, поскольку экспрессия β-актина приблизилась к 2-кратным различиям между обработанными и необработанными условиями в смежные моменты времени после стимуляции, что сильно влияет на влияние экспериментального лечения на относительную экспрессию генов.Также интересно отметить, что эти изменения в экспрессии эталонного гена оказывали заметное влияние на значимость во все моменты времени, когда β-актин превышал допустимый диапазон ΔC _T ≤ +/-0,5. Можно утверждать, что изменчивость β-актина в этих экспериментальных условиях репрезентативна для истинных биологических изменений в экспрессии генов, или нет, эти данные ясно демонстрируют, что тщательная проверка эталонных генов имеет решающее значение при рассмотрении статистической значимости генов-мишеней, особенно тех, которые присутствуют с незначительные изменения в экспрессии генов.

Это исследование также демонстрирует, что крайне неточные выводы могут быть получены в результате исследований, в которых эталонные гены показывают заметные различия в количестве мРНК, которые явно являются результатом лечения или условий исследования. Сравнивая результаты нормализации с различными обычно используемыми эталонными генами, которые демонстрируют бесспорную биологическую изменчивость, мы представили данные двух экспериментов с участием трех целевых генов с четко определенной ролью в дифференцировке адипоцитов, где выбор эталонного гена оказал однозначное влияние на интерпретацию данных.В первом из этих экспериментов (рис. 3) изучали профиль экспрессии C/EBPβ и циклина А в течение первых 24 часов дифференцировки, которая, как известно, включает фазу синхронного прогрессирования клеточного цикла. В то время как профиль экспрессии любого гена не подвергался заметному влиянию при нормализации до 18S, хорошо задокументированная пролонгированная экспрессия C/EBPβ в течение этого периода времени, а также индукция циклина А через 24 часа, необходимая для прогрессирования S-фазы, были полностью устранены, когда нормализация к TfR, который показал собственное 6-кратное увеличение экспрессии генов. Простая нормализация к этому обычно используемому эталонному гену без проверки привела бы к крайне неточным данным, поскольку в результате экспрессия обоих генов снизилась бы, а не увеличилась по сравнению с нестимулированной базальной экспрессией через 24 часа дифференцировки. Аналогичное влияние на результат эксперимента было также отмечено во втором эксперименте (рис. 4), где экспрессия PPARγ была индивидуально нормализована по множеству эталонных генов на протяжении всего курса дифференцировки.Хотя на профиль экспрессии не оказывалось заметного влияния при нормализации до 18S, хорошо задокументированная индукция этого гена-мишени была заметно подавлена ​​при нормализации до TfR, увеличивалась при нормализации до α-tub и задерживалась при нормализации до GAPDH. В этом примере нормализация по неподходящим эталонным генам заметно изменила как кинетику, так и величину экспрессии гена-мишени до такой степени, что, несомненно, привела бы к ошибочной интерпретации данных и выводам исследования.

Основываясь на однозначном влиянии выбора эталонных генов на результаты экспериментов, представленном здесь и в других источниках [14], существует очевидная необходимость в рекомендациях относительно допустимой изменчивости эталонных генов, используемых для нормализации данных [32].В этом отчете мы выбрали критерий, определенный другими [2], который количественно определяет изменения значений C _T данного эталонного гена между обработанными и необработанными состояниями. Мы расширили исходный критерий, изучив изменения значений C _T с течением времени после лечения, чтобы определить, согласуются ли умеренные колебания, представленные спорадическими колебаниями направления, с «шумом», в отличие от тенденций в смежных точках данных, согласующихся с биологическим воздействием на экспрессию генов. .Это расширение считалось особенно ценным при оценке изменений значений C _T между 0,5 и 1,0, как показано здесь для β-актина, когда биологическая тенденция в экспрессии эталонного гена приводила к ошибочному увеличению или потере статистической значимости в отношении представляющих интерес генов. По мере усовершенствования протоколов qRT-PCR стало хорошо известно, что изменения значений C _T ≥ 1,0, представляющие ≥ 2-кратные изменения экспрессии генов, скорее всего, обусловлены биологической дисперсией [2] и ЛПИ (P/ N 4371001, ред. А).Таким образом, эталонные гены, имеющие значения ΔC _T ≥ 1,0, не должны использоваться для нормализации, если действительно наблюдаемые изменения в экспрессии генов связаны с биологическими и техническими различиями, которые в некоторых обстоятельствах может быть трудно различить. Можно утверждать, что использование эталонных генов, которые демонстрируют двукратные изменения в экспрессии генов, может служить цели нормализации, но только в том случае, если дисперсия носит технический характер и требует дополнительных мер (например, оценки с течением времени и т. д.) для установления пригодности при использовании одного референтный ген.

Чтобы решить эти проблемы, другие исследователи предложили нормализовать экспрессию целевого гена до среднего геометрического трех стабильных эталонных генов [33]. В то время как эквивалентные сдвиги направления среди трех эталонных генов будут убедительно свидетельствовать о технических вариациях, поддерживающих использование значений ΔC _T , превышающих 1,0, этот метод нормализации, который требует больших затрат реагентов и рабочей силы, по-прежнему потребует проверки для идентификации трех эталонных генов, которые не отображают индексы биологической дисперсии, поскольку заметное отклонение даже одного гена может существенно повлиять на среднее геометрическое нескольких генов, что приведет к ошибочной интерпретации данных.В некоторых случаях дополнительные расходы могут не понадобиться, как показано здесь и другими авторами [34], где экспериментальный результат с использованием одного стабильного эталонного гена был эквивалентен результату, наблюдаемому при использовании среднего геометрического нескольких стабильных эталонных генов. Также может потребоваться валидация более трех эталонных генов, чтобы идентифицировать по крайней мере три, на которые не влияет биологическая изменчивость, как показано в этом отчете, где валидация целых шести эталонных генов во время дифференцировки адипоцитов не позволила идентифицировать три эталонных гена, которые показал стабильное выражение, подходящее для включения в анализ среднего геометрического. Поэтому крайне важно, чтобы все эталонные гены были проверены для каждого экспериментального условия, независимо от того, является ли выбранным методом нормализации один эталонный ген или среднее геометрическое нескольких эталонных генов. Эта предпосылка должна применяться даже при использовании установленных алгоритмов, которые количественно определяют стабильность генов [4], поскольку различия между типами тканей и клеток или экспериментальное лечение могут привести к биологическим изменениям в экспрессии генов, которая в остальном стабильна или, по крайней мере, не подвержена влиянию биологической изменчивости.

Несмотря на то, что нормализация экспрессии гена-мишени по одному или нескольким эталонным генам является методом выбора многих исследователей [5], [16], важно отметить, что в некоторых ситуациях может потребоваться оценка исходной экспрессии гена-мишени, которая не была скорректирована для техническое отклонение. Поскольку валидация эталонного гена сопряжена со своим собственным набором трудностей, другие авторы также предложили нормализовать экспрессию целевого гена по общей РНК [6], [35]. Однако ни один из методов не исправляет технические отклонения, вызванные ошибкой пипетирования, различиями в эффективности ПЦР или помехами реакции, вызванными загрязняющими реагентами, такими как соли и фенол.Остается предметом споров, какой метод дает наиболее точные экспериментальные результаты. Поскольку один размер может не подойти всем, любой конкретный метод может представлять наилучший подход для данного набора обстоятельств или экспериментальных условий, оставляя исследователю возможность оценить каждый метод в соответствии с требованиями конкретного исследуемого эксперимента.

Критерии валидации, используемые в этом отчете, показали, что 18S рРНК представлена ​​с наименьшей степенью флуктуации из шести эндогенных контролей, протестированных с ΔC _T ≤ +/−0.5 в четырех различных экспериментальных условиях. В то время как 18S был описан как наиболее стабильный эндогенный контроль в различных экспериментальных условиях [15], [36], включая сальниковую и подкожную жировую ткань у пациентов с ожирением и диабетом [15], другие отметили умеренную вариабельность 18S после гормональной стимуляции культивируемых культур. адипоциты человека [2]. Кроме того, сообщалось, что 18S является наиболее нестабильным из эндогенных контролей, испытанных в висцеральной жировой ткани человека с использованием различных алгоритмов, которые количественно определяют стабильность генов [4].Интересно, что последний отчет также продемонстрировал β-актин и GAPDH как одни из наиболее стабильных из эталонных генов, протестированных в определенных экспериментальных условиях. Несмотря на то, что они подтверждены разными критериями, мы не находим эти отчеты противоречивыми, поскольку результаты специфичны для исследуемых экспериментальных условий. Более того, мы чувствуем, что разнообразие этих отчетов свидетельствует о критической важности проверки всех эталонных генов во всех экспериментальных условиях всеми исследователями.Даже в нашем отчете обычно используемые референсные гены, такие как GAPDH, α-tub и TfR, которые подходили в одних условиях, считались крайне неподходящими для других условий в клетках того же типа. Слепое использование любого эталонного гена, включая 18S рРНК, просто потому, что о нем часто сообщается в литературе, не должно быть причиной выбора какого-либо контроля при нормализации экспрессии целевого гена, измеренной с помощью количественной ОТ-ПЦР.

Хотя наши исследования показали, что 18S является наиболее стабильным из эндогенных контролей во всех четырех определенных нами экспериментальных условиях, следует отметить, что существуют опасения по поводу использования рРНК в качестве контроля, который может не подвергаться влиянию механизма деградации в отношении мРНК. [15], [37].Более того, есть некоторые [37], которые задаются вопросом, представляет ли 18S лучший эталонный контроль при нормализации гена-мишени с низким содержанием, который пересекает порог в 24 цикла по сравнению с очень распространенным 18S со значением C _T , равным 9 циклам (таблица 1). ), что соответствует 32 000-кратной разнице в экспрессии генов. Чтобы решить эти проблемы, мы определили, что 18S был линейным от 50 нг до 5 пг в нашем анализе TaqMan и что наклон был почти идентичен наклону из калибровочных кривых, полученных для каждого целевого гена (данные не показаны).Кроме того, мы не наблюдали различий в относительной экспрессии целевого гена при нормализации к неразбавленному 18S при 50 нг по сравнению с разбавленным 18S при 50 мкг, что представляет собой разницу в 10 циклов в значении C _T . Хотя эти данные подтверждают использование 18S в качестве подходящего контроля для нормализации, не следует делать вывод, что это был единственный действительный контроль в нашем исследовании, и его не следует использовать без проверки в каждом экспериментальном условии.

Таким образом, мы проверили шесть часто используемых эталонных генов с целью оценки влияния отбора эталонных генов на нормализацию пяти генов-мишеней в различных экспериментальных условиях, относящихся к биологии адипоцитов.Представлены данные, демонстрирующие, что неправильный выбор референсного гена может оказать сильное влияние на выводы исследования, начиная от расходящихся статистических результатов и заканчивая неточной интерпретацией данных значительной величины. Поскольку все эталонные гены, вероятно, будут колебаться до неприемлемой степени изменчивости в том или ином состоянии, представленные здесь данные настоятельно предостерегают от слепого использования любого эндогенного контроля, который не был проверен специально для изучаемых экспериментальных условий. Использование непроверенных контролей привело к ошибочным результатам, когда сообщаемые изменения в экспрессии целевого гена на самом деле были связаны с изменениями в экспрессии эталонного гена [5], [7], [38]. До тех пор, пока эталонные гены не будут оцениваться на индивидуальной основе для всех экспериментальных условий, ошибочное влияние неправильного выбора эталонного гена на интерпретацию данных и биологический результат, несомненно, будет продолжать способствовать неточным выводам исследования и несоответствиям между отчетами.

Материалы и методы

Протокол клеточной культуры и дифференцировки

мышиных преадипоцитов 3T3-L1, полученных от Howard Green, Harvard Medical School [39], индуцировали к дифференцировке, как описано ранее [17].Вкратце, клетки размножали в питательной среде, содержащей DMEM с добавлением 10% телячьей сыворотки, до достижения остановки плотности через 2 дня после слияния. Для частичных определений общую РНК собирали с течением времени из преадипоцитов с задержанной плотностью, обработанных 1 нМ TNFα или 300 мкМ H ₂ O ₂ , представляющих состояния воспалительного или окислительного стресса, соответственно. Для других определений преадипоциты с задержанной плотностью индуцировали для дифференцировки с помощью гормонального коктейля, содержащего 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) с добавлением DMEM, 0.5 мМ, 1-метил-3-изобутилксантин, 1 мкМ дексаметазона и 1,7 мкМ инсулина (ДАИ). Через 2 дня культуральную среду меняли на DMEM с добавлением только 10% FBS. Поскольку хорошо задокументировано, что эта клеточная линия адипоцитов синхронно повторно входит в клеточный цикл в течение 1-2 раундов клеточного деления до начала экспрессии гена адипоцитов [18, 26], общая РНК была собрана с течением времени после MDI для период в 24 часа, который, как было показано, охватывает один клеточный цикл [19], [20]. Для определения дифференцировки общую РНК собирали из преадипоцитов, индуцированных к дифференцировке, с интервалом в 2 дня в течение 10 дней, что является достаточным временем для превращения преадипоцитов с задержанной плотностью в полностью зрелые адипоциты [25], [26].

ОТ-ПЦР в реальном времени

Тотальную РНК экстрагировали и удаляли примеси геномной ДНК с помощью набора RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen) в соответствии с протоколом производителя, а общую РНК определяли количественно с помощью спектрофотометра Nanodrop ND-1000. Тотальную РНК (2 мкг) подвергали обратной транскрипции в кДНК в реакционном объеме 20 мкл с использованием набора для обратной транскрипции кДНК большой емкости (Applied Biosystems). Мастер-микс для обратной транскрипции (ОТ), содержащий буфер для ОТ, смесь dNTP, случайные праймеры для ОТ, ингибитор РНКазы (1.0 ед/мкл), и MultiScribe RT добавляли к 2 мкг РНК и воды, свободной от РНКазы. Условия реакции обратной транскрипции соответствовали протоколу (выдержка при 25°C в течение 10 минут, выдержка при 37°C в течение 120 минут, выдержка при 85°C в течение 5 секунд, а затем 4°C в течение неопределенного времени/время комнатной температуры завершено) и использовали Gene Amp. Термоциклер PCR System 9700 (Applied Biosystems) для синтеза кДНК.

проводили с использованием быстрой системы 7500 (Applied Biosystems), которая включала активацию фермента при 95°C в течение 20 секунд с последующими 40 циклами денатурации при 95°C в течение 3 секунд в сочетании с отжигом/удлинением при 60°C в течение 30 секунд. Все данные анализировали с помощью системы ПЦР в реальном времени ABI 7500 (Applied Biosystems). Зонды праймеров TaqMan (таблица 1) были приобретены у Applied Biosystems. Данные регистрировали и анализировали с помощью программного обеспечения Sequence Detector (Applied Biosystems), а графики визуализировали с помощью программного обеспечения SigmaPlot. Все данные являются репрезентативными для экспериментов, проведенных не менее трех раз в двух повторностях. Данные представляют собой среднее ± стандартная ошибка среднего (SEM). Относительные различия между обработанными и необработанными контрольными образцами анализировали с помощью t-критерия Стьюдента, где p-значение <0.05 считалось статистически значимым.

Валидация эндогенных контролей измерялась как разница в количестве пороговых циклов (ΔC _T ) между лечением и контролем и преобразовывалась в кратность изменений, как описано ранее [16]. При использовании метода ΔC _T разница в один цикл коррелирует с двукратным увеличением или уменьшением мРНК. При нормализации гена-мишени к эталонному гену использовали метод 2 ^-ΔΔC _T , где ΔΔC _T  =  (C _T,target – C _T,reference ) _{обработанный образец} – (C _T,reference ) _{обработанный образец} – (C _T,target – C _T,reference ) цель – C _{T, ссылка} ) _{необработанный образец} .

Вклад авторов

Задумал и спроектировал эксперименты: BSF RFM. Выполнены опыты: BSF HN RGH. Проанализированы данные: BSF HN RGH RFM. Написал статью: BSF RFM.

Каталожные номера

1. 1. Хаусман Д.Б., ДиДжироламо М., Бартнесс Т.Дж., Хаусман Г.Дж., Мартин Р.Дж. (2001) Биология пролиферации белых адипоцитов. Обес Откр. 2: 239–254.
2. 2. Горзельняк К., Янке Дж., Энгели С., Шарма А.М. (2001)Подтверждение эндогенных контролей для исследований экспрессии генов в адипоцитах и ​​преадипоцитах человека.Horm Metab Res 33: 625–627.
3. 3. Hotamisligil GS, Erbay E (2008)Ощущение питательных веществ и воспаление при метаболических заболеваниях. Nat Rev Immunol 8: 923–924. nri2449 [pii]; дои: https://doi.org/10.1038/nri2449.
4. 4. Мехта Р., Бирердинк А., Хоссейн Н., Афенди А., Чандхок В. и др. (2010) Проверка эндогенных эталонных генов для анализа qRT-PCR образцов висцерального жира человека. BMC Mol Biol 11: 39. 1471-2199-11-39 [pii]; doi: https://doi.org/10.1186/1471-2199-11-39.
5. 5. VanGuilder HD, Vrana KE, Freeman WM (2008)Двадцать пять лет количественной ПЦР для анализа экспрессии генов. Биотехнологии 44: 619–626. 000112776 [пии]; doi: https://doi.org/10.2144/000112776.
6. 6. Bustin SA (2002)Количественная оценка мРНК с использованием ПЦР с обратной транскрипцией в реальном времени (RT-PCR): тенденции и проблемы. Дж. Мол. Эндокринол 29: 23–39. JME01082 [pii].
7. 7. Бастин С.А., Нолан Т. (2004)Ловушки количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в реальном времени. J Biomol Tech 15: 155–166. 15/3/155 [пий].
8. 8. Дхеда К., Хаггетт Дж. Ф., Бастин С. А., Джонсон М. А., Рук Г. и др. (2004) Проверка генов домашнего хозяйства для нормализации экспрессии РНК в ПЦР в реальном времени. Биотехнологии 37: 112–119.
9. 9. Huggett J, Dheda K, Bustin S, Zumla A (2005) Нормализация ОТ-ПЦР в реальном времени; стратегии и соображения. Гены Иммун. 6.: 279–284. 6364190 [и]; doi: https://doi.org/10.1038/sj.gene.6364190.
10. 10. Trowbridge IS, Omary MB (1981)Гликопротеин поверхности клеток человека, связанный с пролиферацией клеток, является рецептором трансферрина.Proc Natl Acad Sci U S A 78: 3039–3043.
11. 11. Spiegelman BM, Farmer SR (1982) Снижение экспрессии генов тубулина и актина до морфологической дифференцировки адипоцитов 3T3. Ячейка 29: 53–60. 0092-8674(82)-7 [pii].
12. 12. Александр М., Кертис Г., Авруч Дж., Гудман Х.М. (1985) Инсулиновая регуляция биосинтеза белка в дифференцированных адипоцитах 3T3. Регуляция глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы. J Biol Chem 260: 11978–11985.
13. 13.Dheda K, Huggett JF, Kim LU, Zumla A (2004)Цитокины типа 2 при респираторно-синцитиальном вирусном бронхиолите. Am J Respir Crit Care Med 169: 1167–1168. 169/10/1167 [pii].
14. 14. Дхеда К., Хаггетт Дж. Ф., Чанг Дж. С., Ким Лу, Бастин С. А. и др. (2005) Последствия использования неподходящего эталонного гена для нормализации данных ПЦР с обратной транскрипцией в реальном времени. Анальный биохим 344: 141–143. S0003-2697(05)00397-0 [pii]; doi: https://doi.org/10.1016/j.ab.2005.05.022.
15. 15.Каталан В., Гомес-Амбрози Дж., Ротеллар Ф., Сильва С., Родригес А. и др. (2007) Проверка эндогенных контрольных генов в жировой ткани человека: отношение к ожирению и сахарному диабету 2 типа, связанному с ожирением. Horm Metab Res 39: 495–500.
16. 16. Livak KJ, Schmittgen TD (2001) Анализ данных об относительной экспрессии генов с использованием количественной ПЦР в реальном времени и метода 2(-Delta Delta C(T)). Методы 25: 402–408. S1046-2023(01)91262-9 [pii]; дои: https://doi.org/10.1006/мет.2001.1262.
17. 17. Auld CA, Fernandes KM, Morrison RF (2007)Skp2-опосредованная деградация p27(Kip1) во время фазы S/G2 прогрессирования гиперплазии адипоцитов. J Cell Physiol 211: 101–111.
18. 18. Tang QQ, Otto TC, Lane MD (2003)Митотическая клональная экспансия: синхронный процесс, необходимый для адипогенеза. Proc Natl Acad Sci U S A 100: 44–49. 0137044100 [пии]; doi: https://doi.org/10.1073/pnas.0137044100.
19. 19. Моррисон Р.Ф., Фармер С.Р. (2000)Гормональная передача сигналов и транскрипционный контроль дифференцировки адипоцитов.Дж. Нутр 130: 3116S–3121S.
20. 20. MacDougald OA, Lane MD (1995)Транскрипционная регуляция экспрессии генов во время дифференцировки адипоцитов. Annu Rev Biochem 64: 345–373. 10.1146/annurev.bi.64.070195.002021 [doi].
21. 21. Cao Z, Umek RM, McKnight SL (1991) Регулируемая экспрессия трех изоформ C/EBP во время жировой конверсии клеток 3T3-L1. Гены Дев 5: 1538–1552.
22. 22. Yeh WC, Cao Z, Classon M, McKnight SL (1995)Каскадная регуляция терминальной дифференцировки адипоцитов тремя членами семейства C/EBP белков лейциновой молнии.Гены Дев 9: 168–181.
23. 23. Hamm JK, Park BH, Farmer SR (2001)Роль C/EBPbeta в регуляции гамма-активности рецептора, активируемого пролифератором пероксисом, во время адипогенеза в преадипоцитах 3T3-L1. J Biol Chem 276: 18464–18471. M100797200 [пии]; doi: https://doi.org/10.1074/jbc.M100797200.
24. 24. Танг К.К., Гронборг М., Хуан Х., Ким Дж.В., Отто Т.С. и др. (2005) Для адипогенеза требуется последовательное фосфорилирование белка бета, связывающего энхансер CCAAT, с помощью MAPK и киназы гликогенсинтазы 3beta.Proc Natl Acad Sci USA 102: 9766–9771. 0503891102 [пии]; doi: https://doi.org/10.1073/pnas.0503891102.
25. 25. Wu Z, Xie Y, Morrison RF, Bucher NL, Farmer SR (1998) PPARgamma индуцирует инсулинозависимый переносчик глюкозы GLUT4 в отсутствие C/EBPalpha во время превращения фибробластов 3T3 в адипоциты. Дж. Клин Инвест 101: 22–32.
26. 26. Morrison RF, Farmer SR (1999)Роль PPARgamma в регуляции каскадной экспрессии ингибиторов циклинзависимой киназы p18(INK4c) и p21(Waf1/Cip1) во время адипогенеза.J Biol Chem 274: 17088–17097.
27. 27. Minshull J, Golsteyn R, Hill CS, Hunt T (1990) Ассоциированные с циклином A- и B-типа киназы cdc2 у Xenopus включаются и выключаются в разное время клеточного цикла. EMBO J 9: 2865–2875.
28. 28. Lehner CF, O’Farrell PH (1990)Роль циклинов A и B дрозофилы в контроле митоза. Ячейка 61: 535–547. 0092-8674(90)90535-M [pii].
29. 29. Tontonoz P, Hu E, Spiegelman BM (1994)Стимуляция адипогенеза в фибробластах с помощью PPAR гамма 2, фактора транскрипции, активируемого липидами.Ячейка 79: 1147–1156. 0092-8674(94)

    -X [pii].

30. 30. Розен Э.Д., Сарраф П., Трой А.Е., Брэдвин Г., Мур К. и др. (1999) PPAR-гамма необходим для дифференцировки жировой ткани in vivo и in vitro. Мол Ячейка 4: 611–617. S1097-2765(00)80211-7 [pii].
31. 31. Hamm JK, el Jack AK, Pilch PF, Farmer SR (1999)Роль гамма-PPAR в регуляции дифференцировки адипоцитов и инсулинозависимого поглощения глюкозы. Ann NY Acad Sci 892: 134–145.
32. 32.Bustin SA (2010) Зачем нужны руководящие принципы публикации qPCR? – Случай с методами MIQE 50: 217–226. S1046-2023(09)00261-8 [pii]; doi: https://doi.org/10.1016/j.ymeth.2009.12.006.
33. 33. Vandesompele J, De PK, Pattyn F, Poppe B, Van RN, et al. (2002) Точная нормализация количественных данных ОТ-ПЦР в реальном времени путем геометрического усреднения нескольких генов внутреннего контроля. Геном Биол 3: RESEARCH0034.
34. 34. Тейлор Д.Л., Томсон П.С., де С.К., Уиттингтон Р.Дж. (2007) Проверка эндогенных эталонных генов для определения профиля экспрессии RAW264.7 клеток, инфицированных Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis с помощью количественной ПЦР Vet Immunol Immunopathol 115: 43–55. S0165-2427(06)00280-7 [pii]; doi: https://doi.org/10.1016/j.vetimm.2006.10.007.
35. 35. Bustin SA (2000) Абсолютная количественная оценка мРНК с использованием полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в реальном времени. Дж. Мол. Эндокринол 25: 169–193. JME00927 [pii].
36. 36. Zhong H, Simons JW (1999) Прямое сравнение GAPDH, бета-актина, циклофилина и 28S рРНК в качестве внутренних стандартов для количественного определения уровней РНК в условиях гипоксии.Biochem Biophys Res Commun 259: 523–526. S0006-291X(99)90815-X [pii]; doi: https://doi.org/10.1006/bbrc.1999.0815.
37. 37. Соланас М., Морал Р., Эскрич Э. (2001)Непригодность использования рибосомной РНК в качестве контроля загрузки для анализа Нозерн-блоттинга, связанного с дисбалансом между содержанием информационной и рибосомной РНК в опухолях молочной железы крыс. Анальный биохим 288: 99–102. S0003-2697(00)94889-9 [pii]; doi: https://doi.org/10.1006/abio.2000.4889.
38. 38. Glare EM, Divjak M, Bailey MJ, Walters EH (2002) Экспрессия генов домашнего хозяйства бета-актина и GAPDH в астматических дыхательных путях вариабельна и не подходит для нормализации уровней мРНК.Торакс 57: 765–770.
39. 39. Djian P, Phillips M, Green H (1985)Активация специфической транскрипции генов при жировой конверсии клеток 3T3. J Cell Physiol 124: 554–556.